外源土壤 Cd脅迫對三七富集及其藥效成分的影響

朱美霖， 陳中堅， 姜 陽， 魏富剛， 崔 斌， 蔣艷雪， 曹紅斌*， 張文生

（1.北京師范大學 中藥資源保護與利用北京市重點實驗室， 北京 100875； 2.北京師范大學 資源藥物教育部工程研究中心， 北京 100875； 3.云南文山苗鄉三七科技有限公司， 云南 文山 663000）

外源土壤 Cd脅迫對三七富集及其藥效成分的影響

朱美霖1，2， 陳中堅3， 姜 陽1，2， 魏富剛3， 崔 斌1，2， 蔣艷雪1，2， 曹紅斌1，2*， 張文生1，2

（1.北京師范大學 中藥資源保護與利用北京市重點實驗室， 北京 100875； 2.北京師范大學 資源藥物教育部工程研究中心， 北京 100875； 3.云南文山苗鄉三七科技有限公司， 云南 文山 663000）

目的 推算三七 GAP種植土壤 Cd 的安全限量濃度。 方法 采用當地土壤添加不同濃度的 CdCl2溶液進行三七盆栽實驗， 考察重金屬 Cd在三七各組織器官中的富集規律及其對主要藥效成分合成的影響， 推得保證三七品質及服用安全性的三七 GAP種植土壤 Cd安全濃度限值。 結果 隨著土壤 Cd濃度的增加， 三七根， 莖， 葉， 花中 Cd量均有明顯增加， 其變化規律符合對數曲線。 三七不同組織富集 Cd能力順序為莖 ＞根 ＞花 ＞葉， 其中莖對 Cd 的吸收最強，富集系數最高。 三七主要藥效成分在土壤 Cd 的量小于 30 mg/kg時， 三七皂苷 R1， 人參皂苷 Rb1， 人參皂苷 Rg1以及總皂苷均未表現出顯著性變化， 當土壤 Cd 的量等于 30 mg/kg， 主要藥效成分量明顯降低。 結論 由中藥中重金屬 Cd的行業限量標準 (0.3 mg/kg)， 根據土壤-三七 Cd 濃度擬合曲線計算出土壤 Cd 濃度安全限量為 0.6 mg/kg。

三七； Cd； 富集； 藥效成分； 安全限量濃度

重金屬污染在世界各地普遍存在，它造成了嚴重的生態和社會問題，并且給人類和其他生物帶來不良影響［1-2］。 Cd 能 造 成植物葉面 卷 曲和黃葉病，損害光合作用和呼吸作用，并且強烈影響植物生長所需酶的活性［3］。 Cd 對人體也有巨大的危害， 可以通過食物、水和空氣進入人體，對腎、肺、肝、睪丸、 腦、 骨骼及血液系統均可產生毒性［4］， 被美國毒物管理委員會 (ATSDR) 列為第六位危害人體健康的有毒物質， Cd在體內的生物半衰期長達 10 ～30 年， 為已知的最易在體內蓄積的毒物［5］。

三七為五加科 Araliaceae植物三七 Panax notoginseng(Burk.)FH.Chen 的干燥根，是我國名貴中藥材。傳統認為其具有散瘀止血、消腫定痛的功效［6］， 現今國內外大量的藥理、 藥效及臨床研究表明，三七對心、腦血管系統疾病具有明顯療效［7］，更有研究顯 示三七具有抗癌活 性［8-9］。 三七提取物中主要含有三七皂苷、黃酮類化合物、糖類成分、揮發油成分、氨基酸成分及各類微量元素，其中三七總皂苷被認為是三七主要的藥效成分。

三七的道地產區本在云南省文山州境內，但由于連作障礙，使文山州境內適宜種植三七的地塊急劇減少，導致三七種植不斷向州外的紅河州、昆明市、曲靖市及玉溪市等地區轉移。這些地區擁有豐富的鉛鋅礦床， 而鉛鋅礦床是Cd富集最常見的場所。由于長時間大規模的礦業活動會導致大量 Cd從礦石中釋放出來并向表生環境遷移，給當地生態環境造成了污染［10］。由此導致栽培三七 Cd 殘留超標事件的發生［11］，嚴重制約了這些地區三七產業的發展。 目前， 三七GAP種植的土壤含 Cd量標準參照國家標準 GB1561821995 《土壤環境質量標準》 規定的標準 0.3 mg/kg， 而由于種植地區 Cd本底較高，要達到這一標準的土地很少，這給GAP選址帶來困難。 因此， 有必要通過實驗手段確定土壤中 Cd的安全濃度限值以指導三七GAP種植基地選址，對三七的安全性、 品質及其 GAP種植均具有重要意義。

1 材料和儀器

1.1 試劑 CdCl2·2.5H2O( 分析純， 天津市津科精細化工研究所)， 黃芪對照品 (GBW10028)，土壤對照品 (GBW07401)， 三七皂苷 R1對照品(110745)， 人 參 皂 苷 Rg1對 照 品 (GBW(E) 090095)，人參皂苷 Rb1對照品 (110703)， 鹽酸、硝酸、高氯酸、氫氟酸 (北京精細化工有限公司)甲醇 (色譜純， Fisher)。

1.2 儀 器 研 磨 儀 (ZM200 pulverisette 14， 德國)， 烘箱 (上海精密實驗設備有限公司)， 自動消解儀 (ST-60 型， 北京普利泰科儀器有限公司)，ICP-AES(SPECTRO ARCOS EOP， 美 國)， HPLC儀 (Waters2487， 美 國 )， Mill-Q 超 純 水 儀 ( 美國)。

2 方法

2.1 盆栽實驗和樣品采集 盆栽實驗于 2012 年 1月在苗鄉三七有限公司的云南硯山實驗基地進行，地處 E:104.392 7°， N:24.719 7°， 實驗進行中溫室溫度保持在 22 ～25 ℃。 供試土壤來自基地附近 0 ～20 cm的表層土， 土壤理化性質如表 1 所示。先將實驗所用土壤用 0.5 cm的尼龍篩過篩， 然后稱取適量的土壤，配制質量分數分別為 0、 0.1、0.3、0.6、1、3、 6、 10、30 mg/kg的 Cd 鹽(CdCl2·2.5H2O) 溶液， 噴灑到土壤中并攪拌均勻， 每個花盆中加入 5 kg土壤， 每個質量分數設有4個平行。之后移栽生長健壯并且生長狀況相似的一年生三七種苗到花盆中，每盆栽種5株。在生長過程中，正常使用氮磷鉀肥，避免使用含重金屬的肥料， 并且觀察記錄生長狀況。 同年 10月， 采集成熟的二年生三七及其根際土壤，帶回實驗室后，將三七的根，莖，葉，花分開，并分別依次用自來水、 蒸餾水洗凈， 55 ℃烘干 72 h， 粉碎并過0.5 mm篩備用。 土壤陰干， 粉碎并過 0.5 mm篩備用。

表1 供試土壤理化性質及 Cd量Tab.1 Physico-chem ical properties and Cd content of the test soil

2.2 Cd 的測試方法

2.2.1 植物樣品待測液制備 精確定量稱取混勻植物樣品 0.2 g(精確至 0.000 1 g)， 加入 2 mL硝酸 (優級純) 和 1 mL雙氧水 (優級純)， 置于聚四氟乙烯罐，放入不銹鋼外套中，擰緊，在烘箱中160 ℃加熱 4 h， 冷卻后取出罐， 用超純水定容至10 mL， 搖勻， 待測。 同時做空白實驗。 處理液根據實際樣品含有量情況再稀釋，上機測定。

2.2.2 土壤樣品待測液制備 土壤樣稱量 0.1 g (精確到 0.000 1 g)，置于聚四氟乙烯消解罐中，加 15 m L硝酸、 2 mL氫氟酸， 放于自動消解儀中于 140 ℃加熱 1 h， 加入 1 mL高氯酸后升溫到160℃加熱 1 h，升溫到 180 ℃加熱 45 min 后取下回流漏斗， 趕酸至近干。 冷卻后用高純水定容至 25 m L， 用 ICP-AES 光譜儀測定無機元素。

2.2.3 Cd 元素的測定 采用 ICP-AES 的方法測定重金屬 Cd(北京師范大學分析測試中心， 2013)，ICP-AES 主要工作參 數 為: 發 生 器 功 率 1.4 kW，冷卻氣體 積流量 12 L/min， 輔助 氣體積流量 0.8 L/min， 載氣體積流量 0.8 L/min。

以國家化學標準樣黃芪 (GBW10028) 內插進行植物樣品分析質量控制，以國家化學標準土壤樣(GBW07401) 內插進行土壤樣品分析質量控制。黃芪和土壤標準物測定結果分別為 4.32(標準值為 4.3 ±0.6 mg/kg) 和 0.041(標準值為0.042 ± 0.010)。

2.3 藥效成分測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷 Rg1對照品、 人參皂苷 Rb1對照品及三七皂苷 R1對照品適量，加甲醇制成每 1 mL含人參皂苷 Rg10.4 mg、 人參皂苷 Rb10.4 mg、 三七皂苷 R10.1 mg的混合溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液制備 取三七根部粉末 0.2 g，置于10 mL離心管中， 加 5 mL甲醇， 稱定質量，超聲 30 min， 再稱定質量， 必要時用甲醇補足減輕的質量。 混勻， 離心 5 min(約 540 ×g)， 用 0.45 μL微孔濾膜過濾。

2.3.3 色譜條件 液相色譜 (HPLC) 檢測波長為 203 nm， Agilent Tc-C18色譜 柱 (4.6 mm×250 mm， 5 μm) 填充， 柱溫 25 ℃， 體積流量 1.6 mL/min， 流動相為水 (A) 和乙腈 (B) ， 梯度洗脫， 0 ～20 min(80%A)， 20 ～60 min(80%-58%A)。

3種標準物質在此色譜條件下線性關系良好。日內精密度、日間精密度都小于5%，供試樣品溶液在 12 h 內基本穩定，樣品回收率為 97% ～102%。 表明測定三七主要藥效成分的方法可靠。

2.4 數據分析 試驗數據用 Microsoft Excel 2010和 SPSS 18.0 軟件進行方差分析及回歸分析， 數值表示采用3次重復的平均值±標準差。

3 結果與分析

3.1 不同 Cd 處理下三七中 Cd 量和富集系數

3.1.1 實測土壤含 Cd 量與名義含 Cd 量的關系 為了驗證設置含Cd量的可靠性， 對土壤中的 Cd 進行檢測， 并將結果與名義含Cd量進行對比， 結果發現名義Cd 量和實測含 Cd 量之間符合以下關系:y= 1.147 2x+0.536 6(r2=0.987 6)， 其中 y代表實測含 Cd 量， x代表名義含Cd 量。 斜率接近1， 說明實測含 Cd量減掉本底 (截距值) 后與名義含 Cd 量基本相等， 從而證明土壤Cd處理質量分數可靠。

3.1.2 不同組織器官中 Cd 量 由圖 1 可以看出，隨著 Cd處理質量分數的增加， 三七根、 莖、 葉、花中 Cd量也呈增加趨勢。 當 Cd 處理質量分數為30 mg/kg， 各個組織 (根、 莖、 葉、 花) 的 Cd 量分別是 13.24、34.9、 11.96、9.07 mg/kg， 分別為對照組的 37、47、 43、 22 倍。 由此可見，莖對 Cd的吸收量在四者之中為最高，且變化幅度最大，說明莖對Cd的吸收能力最強。

圖1 不同濃度 C d處理下三七組織器官中Cd量變化趨勢圖Fig.1 Cd content in different tissues of Panax notoginseng under soil Cd stress

以土壤 Cd 實測含 Cd 量為 x，三七不同組織中Cd量為 y進行擬合， 得到三七根、 莖、葉、 花中Cd的量都符合對數分布， 如圖2所示， 從圖中可以看出， 在低質量分數Cd處理的土壤中， 三七組織中 Cd量增長迅速，所以為了控制三七中 Cd量，必需要嚴格控制三七種植土壤中含Cd量。

其擬合方程見表2。

表2 三七不同組織器官中含 Cd量變化擬合方程Tab.2 Regression equation of Cd content in different tissues of Panax notoginseng

圖2 三七不同組織中 C d量擬合曲線圖Fig.2 Regression curve of Cd content in different tissues of Panax Notoginseng

表3 三七不同組織對 Cd的富集系數Tab.3 Cd accumulation factor in different tissues of Panax notoginseng

3.1.3 不同組織器官的富集系數 富集系數是衡量植物對重金屬累積能力大小的一個重要指標，Cd在三七中的富集系數定義為三七組織中 Cd量與土壤中 Cd 量的比值。 比值大小反應不同組織對 Cd吸收累積能力的大小。從表3可看出，三七各個組織的富集系數都呈現相同的特點，即富集系數隨著土壤中 Cd量的增加呈現先上升后下降的趨勢，說明三七對 Cd 的富集也存在一定限度。 當土壤含 Cd量為1mg/kg時， 根的富集系數為 2.47，達到最大值， 說明根對土壤中Cd的吸收富集能力在此時最強，并且表現出超富集植物的特性；莖在整個濃度范圍內都表現出強的富集能力 (富集系數為0.98 ～4.27)； 葉在整個濃度范圍內表現出相對較弱的富集能力 (富集系數為 0.56 ～0.94)； 花也在土壤含 Cd 量為 1 mg/kg時達到最大值 1.70(小于2.47)， 說明富集能力小于根的富集能力。 而在相同情況下，莖的富集系數是最高的，同樣說明三七莖對 Cd的吸收能力最強。綜上所述， 得到三七不同組織對 Cd富集能力如下: 莖 ＞根 ＞花 ＞葉。

3.2 不同 Cd 處理下三七主要藥效成分變化 不同質量分數 Cd處理下三七根莖部主要藥效成分含有量變化如圖3所示。從圖中可以看出，三七皂苷R1在 土 壤 含 Cd 量 為 6 mg/kg時 達 到 最 大 值2.296%， 在 0.1、 1、 3 mg/kg其 含有量也較 高(分別為 1.691%、1.974%、1.823%)， 并且在 10 mg/kg和 30 mg/kg時顯著降低， 說明要確保三七皂苷 R1較高的累積， 必須土壤含 Cd 量小于 10 mg/kg； 人參皂苷 Rb1的變化在 0 ～10 mg/kg的范圍內表現出先降低再逐漸升高的趨勢， 在 30 mg/kg時， 表現出量顯著降低， 所以為了讓人參皂苷 Rb1較高累積， 就要確保土壤含 Cd 量盡可能?。?人參皂苷 Rg1在土壤含 Cd 量為 0.6 mg/kg時累積 量 達 到 最 大 0.396%， 在 0 mg/kg和 0.1 mg/kg時累積量較高， 當土壤含 Cd 量為其他質量分數時累積量比較低； 總皂苷 (3種皂苷量之和)在 0 ～10 mg/kg均未表現出顯著性差異， 當土壤含Cd 量達到 30 mg/kg時，含有量相對于對照組明顯下降， 說明在一定范圍內， 三七對 Cd表現出一定的抗性， 而超過一定限度 (30 mg/kg)， 抗性就會減弱，從而破壞三七的品質。

3.3 三七種植 GAP土壤 Cd 安全濃度限值修訂

圖3 土壤 Cd脅迫對三七主要藥效成分的影響Fig.3 Effect of soil Cd stress on the conten t of active com positions of Panax notoginseng

我國 《藥用植物及制劑外經貿綠色行業標準》(WM/T2-2004) 對中藥中重金屬 Cd 的限量為 0.3 mg/kg［12］， 將限量標準帶入根、 莖、 葉、花的擬合方程， 得到土壤限量值分別為 0.66、 0.76、 0.95、0.60 mg/kg。 所以， 為了保證根、 莖、 葉、 花都不超標， 土壤含 Cd 量應該≤0.60 mg/kg。 而 《原產地域產品文山三七》 (GB 19086-2003) 中對于三七中重金屬的限量是 Cd ≤0.5 mg/kg［13］， 如果按照此標準， 得到土壤限量值分別為 0.70、0.78、1.01、 0.66 mg/kg， 進而得到土壤含 Cd 量應該≤0.66 mg/kg。 由于盆栽試驗添加的是 Cd 鹽溶液，雖然添加時三七種苗處于休眠期 (1 月)， 到生長期 (3 月) 有 2 個月的土壤老化期。 但土壤中 Cd的生物有效態濃度比例仍有可能高于自然土壤，易于被三七吸收利用。 因此，本試驗 Cd的富集系數可能為過大評價。 由此推得的土壤Cd濃度安全限值為保守推定，較為安全。

4 討論

4.1 三七不同組織對 Cd 的富集能力 植物對重金屬具有很強的耐性并不一定就是超富集植物。根據超積累植物定義， Cd超積累植物地上部位的重金屬量達到 100 mg/kg［14］， 且富集系數要大于 1。本研究的結果表明，雖然在一些質量分數時，有不同的組織， 尤其是莖的富集系數大于1， 但其質量分數值卻遠遠小于 100 mg/kg， 所以三七并非是 Cd的超富集植物。

研究結果發現莖對 Cd的富集能力最強， 此結果與馮光泉［15］的研究相似， 其研究發現三七莖葉中 Cd的量高于主根， 但是將莖葉混合在一起不能比較他們各自富集能力的大??；其他植物也有與三七相似的結果， 李云等［16］研究野茼蒿對 Cd 富集能力， 發現地上部分對Cd的累積遠遠高于根部 (占整個植株 Cd 累積總量的 86.83% ～96.09%)， 但是也未能詳細的探討地上的各個組織對 Cd的富集狀況。而大多數農作物的富集規律與三七不同，Grant等［17］通過對他人實驗的結果統計發現 Cd 被農作物吸收后中大多數累計在根部，少部分被傳輸到莖葉和籽粒中，表現富集能力大小為根 ＞莖＞葉＞籽粒。所以，不能籠統地采用農作物種植土壤Cd濃度標準作為三七GAP種植標準。

4.2 三七主要藥效成分 中藥材的質量主要是指藥效成分含有量。 三七主要藥效成分三七皂苷 R1、人參皂苷 Rb1、 人參皂苷 Rg1的量在 Cd 脅迫下表現出不同的變化規律，但進行統計學分析后，與對照相比并沒有表現出顯著性差異，說明三七對 Cd有一定的抗性。Cd對其他中藥材的主要藥效成分影響有一些研究， 張旭等［18］采用盆栽試驗研究了在不同水平 Cd污染的土壤上， 對板藍根主要藥用成分靛玉紅的影響，發現隨著在土壤中重金屬 Cd的施用量的增大，主要藥用成分靛玉紅含有量降低，品質下降。其他金屬對三七藥效成分的影響也有研究， 曾鴻 超 等［19］研 究 類 金屬 砷 對 三七 皂 苷R1、 人參皂苷 Rb1、 人參皂苷 Rg1的影響， 發現隨著土壤砷濃度增加，各種皂苷以及總皂苷含量顯著降低。 與本研究比較，可能原因是三七對 Cd的耐性強于三七對砷的耐性。

《中國藥典》 2010 年版要求三七飲片按干燥品計算， 含人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Rb1和三七皂苷R1三者的總量不得少于 5.0%，即 50 mg/g。 本實驗結果測得大部分濃度下總皂苷量均低于藥典要求。可能的原因是人工大棚的生長環境不如大田環境那樣 適宜 三 七 的生 長［20-21］， 再 次， 實 驗 所 用 三七為二年生三七，其藥效成分累積量不如三年生三七［22-23］。

4.3 三七 GAP種植土壤標準 三七是我國大宗出口的中藥材之一， 主要重金屬污染為砷和 Cd， 有研究統計數據顯示［11］， 三七藥材 Cd 的超標率為50%左右， 超標嚴重。 而藥材中 Cd 量超標的主要原因是種植土壤 Cd 超標， 目前三七 GAP種植地Cd 的 標 準 采 用 土 壤 環 境 質 量 標 準 (GB15618-1995)。 由于植物對 Cd 富集能力不同， 而且三七的種植地大多是富 Cd區域， 采用統一的標準將使選址受到影響。因此采用實驗的方法得到了三七對Cd的富集規律， 再根據國家標準反推出土壤濃度限量為 0.6mg/kg， 此濃度限量更符合三七的實際情況。

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Cadm ium stress of soil on cadm ium enrichm ent in different tissues and itsm ain active com positions of Panax notoginseng

ZHU Mei-lin1，2， CHEN Zhong-jian3， JIANG Yang1，2， WEI Fu-gang3， CUI Bin1，2， JIANG Yanxue1，2， CAO Hong-bin1，2*， ZHANGWen-sheng1，2
(1.Beijing Area Major Laboratory of Protection and Utilization of Traditional Chinese Medicine， Beijing Normal University， Beijing 100875， China； 2. Center for Natural Medicine Engineering， Ministry of Education， College of Resources Science&Technology， Beijing Normal University， Beijing 100875，China； 3.Miaoxiang Sanqi Co.， Ltd， Yunnan 663000， China)

AIM To calculate the Cadmium(Cd)safety limit concentration of planting soil suitable for GAP of Panax notoginseng.METHODS Pot experiment was carried out through adding different concentrations of CdCl2to the local soil.Cd accumulation in different tissues and the effectof Cd on main active compositionswere estimated to conjecture the limit concentration guaranteeing the quality and edible safety of Panax notoginseng.RESULTS The Cd contents in root， stem， leaf and flower all increased with the Cd concentration increase in soil and their regression curves fitted the logistic curve.In addition， the Cd enrichmentwas arranged in descend order as the follow:stem＞root＞flower＞leaf.Another finding was that themain active compositions(notoginseng R1，ginsenoside Rb1， ginsenaside Rg1and total sponions)did not change significantly at the Cd concentration less than 30 mg/kg， but the main active compositions decreased obviouly at Cd concentration more than 30 mg/kg.CONCLUSION According to the safety limitation of Cd in herbalmedicines(0.3 mg/kg)and the soil-plant Cd concentration regression curve， the soil limit concentration is recommended as0.6 mg/kg.

Panax notoginseng； cadmium； enrichment； active compositions； security limit concentration

R284.1

:A

:1001-1528(2014)02-0342-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.028

2013-04-24

中央高校基本科研業務費專項資金資助 (105564)

朱美霖 (1987—)， 女， 博士生， 研究方向: 天然藥物重金屬安全性評價。 Tel:(010)62205282

*通信作者: 曹紅斌， 教授， 博士生導師。 Tel:(010)62200669， E-mail:caohongbin@bnu.edu.cn