土家苗藥夜關門對小鼠實驗性失眠的療效觀察與機制初探

郜紅利， 涂 星， 盧 映， 張 方

（1.湖北民族學院中醫藥學院， 湖北 恩施 435500； 2.廣州中醫藥大學， 廣東 廣州 510006； 3.恩施自治州優撫醫院， 湖北 恩施 445000）

［科研報道］

土家苗藥夜關門對小鼠實驗性失眠的療效觀察與機制初探

郜紅利1， 涂 星2， 盧 映2， 張 方3

（1.湖北民族學院中醫藥學院， 湖北 恩施 435500； 2.廣州中醫藥大學， 廣東 廣州 510006； 3.恩施自治州優撫醫院， 湖北 恩施 445000）

目的 探討土家苗藥夜關門對小鼠實驗性失眠的藥效作用，并進行初步的機理研究。方法 以對氯苯丙氨酸誘導實驗型完全失眠小鼠模型，分為正常組、模型組、高、中、低劑量給藥組、安定組，分別給予相應藥物，觀察小鼠一般行為學特征； 取腦組織， 測定超氧化物歧化酶 SOD及 NO水平。 結果 不同劑量的夜關門均能顯著性減少模型小鼠 3 min 內活動次數、 改善體表特征、 降低其腦組織中 NO的水平 (P＜0.05)； 中、 高劑量夜關門提取液能顯著性降低失眠小鼠腦組織中過高的 SOD水平 (P＜0.05)， 與安定無顯著性差異， 高劑量組可使過高的 SOD水平恢復至正常水平。結論 夜關門對對氯苯丙氨酸誘導的失眠小鼠具有較好的治療作用，該作用可能是通過降低其腦組織中 NO和SOD的水平實現的。

夜關門；對氯苯丙氨酸；睡眠剝奪；一氧化氮；超氧化物歧化酶

失眠 (insomnia) 是指患 者對睡眠時 間和 ( 或) 睡眠質量不滿足并影響白天社會功能的一種主觀體驗，目前常用苯二氮卓類和非苯二氮卓類催眠藥物進行治療，但易產生不良反應或戒斷綜合征［1］。 持續的覺醒或睡眠剝奪作為一種急性氧化應激對機體免疫、內分泌及神經系統有明顯影響，尤其對腦功能的影響十分顯著，已有實驗證明，睡眠剝奪可出現腦氧化，而大量的自由基和 NO參與了腦神經細胞的毒性損傷［2-3］。 土家苗藥夜關門具有 “ 晝開夜合”的生物節律現象，說明其有安神入眠的作用，現代研究表明，其中發揮中樞抑制和鎮靜作用的成分可能是琥珀酸等［4，5］。 本研究擬 以睡眠剝 奪 小鼠模型 為 研 究 對 象， 考 察土家苗藥夜關門對失眠動物的影響，為其安神入眠作用提供合理的依據和參考。

1 材料

1.1 動物與分組 健康 SPF級 SD小鼠 60 只， 體質量(200 ±20)g， 由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供， 許可證號 SCXK(粵)2013-0020。 將小鼠按照隨機數字表法分為模型組 (n=50) 和正常組 (n=10)。 每只小鼠均在相同條件下，自由飲水、攝食，保持自然光節律。

1.2 試劑及藥物 對氯苯丙氨酸， 購于美國 Sigma公司；NO、 SOD試劑盒， 購于南京建成生物制劑研究所； 夜關門，采集于湖北省恩施州利川市佛寶山自然森林保護區，經湖北民族學院朱敏英教授鑒定為豆科植物截葉鐵掃帚Lespedeza cuneata(Dum.Cours.)G.Don 的全草； 其他試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備 UV-7504 紫外可見分光光度計 ( 上海欣茂儀器有限公司)； 微量有機分析專用超純水機 (伊洋企業發展有限公司)； 小鼠自主活動測試儀 (成都泰盟科技有限公司)； Anke TGL-16B離心機； JK5200B超聲波清洗器；分析天平等。

1.4 藥液的配制 對氯苯丙氨酸液配制: 精密稱取對氯苯丙氨酸3.000 0 g， 加弱堿性生理鹽水 (pH7 ～8) 溶解并定容至 100 mL， 即得 30 mg/mL的對氯苯丙氨酸混懸液。

夜關門水煎液: 稱取夜關門粗粉約 2 000 g， 加 6 倍水煎煮3次， 每次 1 h， 合并煎液， 濃縮至含生藥量為1 g/mL， 即得夜關門水煎液， -4 ℃保存備用。

2 方法

2.1 動物造模及給藥 模型組小鼠于每天上午 8:00 ～8:30按 10mL/kg用量腹腔注射對氯苯丙氨酸液， 正常組小鼠同時間等量腹腔注射弱堿性生理鹽水 (pH7 ～8)， 連續2 d。 動物出現晝夜節律消失， 白天也活動不停， 整體觀察與正常對照組有明顯不同，表明模型復制成功，剔除不成功的動物模型。 選取失眠模型動物40只， 分為模型對照組、高、中、低劑量給藥組及安定組，每組8只。

于第3 天開始每天上午8:00 開始， 參照參考文獻 ［6］設定夜關門高、 中、 低劑量分別為 12.3、 6.15、 3.1 mL/kg (夜關門成人日用劑量為 30 g， 其小鼠臨床等效劑量為6.15 g/kg)， 安定組 3.1 g/kg灌胃給藥， 模型對照組和正常組給予同體積生理鹽水， 每天1次， 連續灌胃7 d。

2.2 動物一般行為學觀察 末次給藥后， 觀察比較各組小鼠的體表特征， 并進行積分評分［7］。 評分標準: ①精神狀態及對外界的刺激反應；②眼睛眼裂變窄，嗜睡等；③面部、口鼻黏膜和爪；④食欲、體質量和消瘦程度；⑤皮毛毛色和光澤。按照5個等級進行積分，狀態好的5分，狀態差為1分， 共計25分。

在末次給藥1 h后，將小鼠放入自主活動儀中，待小鼠適應 5 min 后， 計數 并 打 印 3 min 內站 立 次 數， 連 續 2次，取平均值進行統計分析。

2.3 SOD、 NO水平的測定 將各組大鼠脫頸椎處死， 剪開頭骨，掀去顱骨，以生理鹽水洗凈后取出大腦，置于吸水紙上稱重，吸去多余的水分，稱取吸水紙質量，兩者之差即為腦組織凈重， 置于 -80 ℃液氮中保存。

按照試劑盒說明書， 采用黃嘌呤氧化還原法測試 SOD水平， 采用硝酸還原酶法測定大腦內的 NO水平。

2.4 數據的處理與統計 采用 SPSS 13.0 軟件進行統計學分析， 所有檢測結果以均數 ±標準差 (-) 表示， 組間比較采用 One-Way ANOVA檢驗， 雙側檢驗顯著性水平取 α =0.05。

3 結果

3.1 夜關門對小鼠一般行為學的影響 觀察發現， 各組小鼠的進食、飲水、排便和毛色的變化無明顯差異，但模型組小鼠的眼裂變寬，精神躁動，對外界的刺激產生的應激增強，自主活動加快，給藥后上述癥狀均能得到一定程度的緩解。見表1。

表 1 小鼠一般行為學特征變化分析 （ ˉ， n=8）

表 1 小鼠一般行為學特征變化分析 （ ˉ， n=8）

注: 與正常對照組比較，*P＜0.05； 與模型對照組比較，△P＜0.05； 與安定對照組比較，▲P＜0.05

組 別3 min 內小鼠活動次數小鼠外觀評分正常對照組7.10 ±1.5224.50 ±0.53模型對照組31.13 ±3.44*▲14.63 ±1.19*▲夜關門低劑量組21.25 ±3.33*△▲15.63 ±1.3*▲夜關門中劑量組10.88 ±1.96*△▲20.13 ±1.5*△夜關門高劑量組15.13 ±3.04*△▲19.25 ±1.49*△▲安定陽性對照組5.88 ±9.16△22.38 ±1.19*△

由該研究結果可以看出，給予夜關門不同劑量的提取液后， 均能顯著性減少模型大鼠 3 min 內小鼠活動次數(P＜0.05)， 但遠不如給予安定所達到的治療效果。 對于小鼠體表特征的影響而言，不同劑量的夜關門與安定均能顯著改善對氯苯丙氨酸所引起的不良生理狀態 (P＜0.05)， 且中劑量的夜關門提取液與安定的效果無顯著性差異 (P＞0.05)。

3.2 夜關門對小鼠腦組織中 NO和 SOD的影響 由研究結果可知， 對氯苯丙氨酸能導致正常小鼠腦組織中 NO、 SOD水平顯著性升高 (P＜0.05)， 提示對氯苯丙氨酸可能是通過引起大鼠腦組織中該類物質的變化而誘導小鼠失眠；不同劑量夜關門提取液均能顯著性降低失眠小鼠腦組織中NO水平 (P＜0.05)， 且兩者之間無明顯的量效關系； 中劑量和高劑量夜關門提取液能顯著性降低失眠小鼠腦組織中SOD水平 (P＜0.05)， 低劑量夜關門提取液對 SOD的影響不顯著， 提示夜關門對失眠小鼠腦組織中 SOD水平的影響與給藥劑量之間存在這一定的量效關系。此外，研究結果顯示， 中、 高劑量夜關門提取液降低 SOD水平效果與安定無顯著性差異， 高劑量組可使失眠小鼠過高的 SOD水平恢復至正常水平。 見表2。

表 2 夜關門對小鼠腦組織中 NO 和 SOD水平的影響（ ˉ， n=8）

表 2 夜關門對小鼠腦組織中 NO 和 SOD水平的影響（ ˉ， n=8）

注: 與正常對照組比較，*P＜0.05； 與模型對照組比較，△P＜0.05； 與安定對照組比較，▲P＜0.05

組 別NO/( μmol/gprot)SOD/(U/mgprot )正常對照組3.257 5 ±0.096 6 415.707 5 ±29.952 0模型對照組6.060 0 ±0.183 0*481.138 8 ±32.023 5*夜關門低劑量組5.162 5 ±0.151 4*△▲451.162 5 ±31.524 7夜關門中劑量組4.026 3 ±0.214 0*△▲431.411 3 ±9.432 5△夜關門高劑量組4.198 8 ±0.304 7*△▲417.495 0 ±21.169 3△安定陽性對照組3.038 8 ±0.177 2△429.526 3 ±14.898 9△

4 討論

4.1 對氯苯丙氨酸誘導失眠模型是目前公認的， 并廣泛應用于 5-HT及其與其他遞質之間關系研究的經典動物模型［6］， 目前研究表明， 對氯苯丙氨酸失眠模型與中醫心腎不交模型的病癥相似［8］。 本實驗的研究結果表明， 夜關門對對氯苯丙氨酸誘導的失眠小鼠具有較好的治療作用，能減少其自主活動以及對外界刺激的應激性，提示夜關門可用于心腎不交所致失眠患者臨床干預。

4.2 一氧化氮是細胞與細胞間信息傳遞的重要調節因子，作為第一信使和神經遞質在神經系統中具有重要作用。現代研究表明， 剝奪睡眠會導致機體NO產生增多， 而 NO具有促進睡眠的作用，能引起集體疲勞感和睡意。 NO可以通過 cGMP消除氧自由基， 保護腦細胞， 但過量的 NO可以轉化成為作用很強的氧自由基， 反而加重腦損傷［9］。 本研究結果表明， 對氯苯丙氨酸剝奪睡眠 48 h后， 大鼠腦內NO水平升高， 而夜關門可以顯著降低NO的水平， 避免過量的NO加重腦損傷。

4.3 超氧化物歧化酶 (SOD) 是人體內最重要的自由基清除劑。 現代研究表明， SOD可清除體內過量活性氧， 保護細胞生物膜和腦細胞，其活性高低反應機體清除氧自由基的能力［10-11］。 本實驗研究結果表 明， 對氯苯丙氨酸剝奪睡眠 48 h 后， 小鼠腦組織中 SOD活性顯著增高， 說明對氯苯丙氨酸可誘導自由基清除系統出現反應性升高。而給以夜關門提取物后腦組織中 SOD水平有所下降， 且其下降趨勢與夜關門給藥劑量成正比，給以高劑量夜關門提取物時其SOD水平接近正常大鼠腦組織中 SOD水平， 提示夜關門能消除氧自由基，減輕對氯苯丙氨酸所致的小鼠神經細胞損傷，具有較好的腦保護作用，為夜關門緩解失眠提供了實驗依據。

本研究是基于對氯苯丙氨酸誘導的實驗性失眠模型而展開的，屬于短期失眠行為，而失眠是一個復雜而特殊的病理現象，因此本研究還存在一定的缺陷。如何找到一個更切合實際的動物模型，適當地選擇與失眠相關的特異性和非特異性指標，還有待進一步深入研究。

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R285.5

:B

:1001-1528(2014)02-0383-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.037

2013-09-18

郜紅利 (1967—) ， 男 ( 土家族) ， 副教授， 研究方向: 民族藥物 的開發與利用。 Tel:(0718)8437810， E-mail:349523825 @qq.com