菟絲子生制品提取物中槲皮苷在大鼠血漿的藥動(dòng)學(xué)特征比較

王 莉， 張學(xué)蘭， 趙資堂， 李慧芬， 劉 洋

（山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟(jì)南 250355）

菟絲子生制品提取物中槲皮苷在大鼠血漿的藥動(dòng)學(xué)特征比較

王 莉， 張學(xué)蘭*， 趙資堂， 李慧芬， 劉 洋

（山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟(jì)南 250355）

目的 研究菟絲子生品與鹽炙品提取物中槲皮苷在大鼠血漿的藥動(dòng)學(xué)特征，比較炮制對(duì)其吸收代謝的影響。方法 大鼠分別灌胃給予生菟絲子和鹽菟絲子提取物， 于給藥前及給藥后不同時(shí)間點(diǎn)采集血樣， HPLC-UV法測(cè)定大鼠血漿中槲皮苷的質(zhì)量濃度， 所得數(shù)據(jù)用 DAS2.1 軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析。 結(jié)果 血漿中槲皮苷在 0.148 ～29.6 μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 相關(guān)系數(shù) r=0.997 0， 日內(nèi)日間精密度均小于 10%， 相對(duì)回收率在 83.11% ～103.58%，準(zhǔn)確度、精密度均符合生物樣品的測(cè)定要求。生菟絲子和鹽菟絲子提取物灌胃后血漿中槲皮苷的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別為 AUC(0-t)=(10.419 ±0.376) μg/mL· h， AUC(0-∞)=(10.745 ±0.393) μg/mL· h， Cmax=(5.398 ±0.202) μg/m L， t1/2=(1.157 ±0.156)h 和 AUC(0-t)=(16.485 ±0.351) μg/mL·h，AUC(0-∞)=(18.354 ±0.715) μg/mL· h，Cmax=(11.465 ±0.274) μg/mL， t1/2=(1.914 ±0.299)h。 結(jié)論 槲皮苷藥動(dòng)學(xué)行為符合二房室模型， 鹽炙能促進(jìn)槲皮苷在體內(nèi)的吸收，并能延緩其體內(nèi)消除過(guò)程，為闡明菟絲子鹽炙增效機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。

菟絲子； 鹽炙； 槲皮苷； 血漿藥動(dòng)學(xué)； HPLC-UV

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子 Cuscuta australis R. Br.或菟絲子 Cuscuta chinensis Lam.的 干 燥成熟種 子， 具有滋補(bǔ)肝腎、 固精縮尿、 安胎、 明目、 止瀉之功效［1］。 黃酮類(lèi)化合物為菟絲子的主要活性成分，主要有金絲桃苷、槲皮苷、 槲皮素等［2］。 藥理研究表明， 菟絲子總黃酮具有促進(jìn)成骨細(xì)胞活性［3］， 抗衰老［4］， 增強(qiáng)機(jī)體免疫［5］、 調(diào)節(jié)內(nèi)分泌［6］及保護(hù)血管作用［7］。 其中槲皮苷具有抗氧化清除自由基［8］， 鎮(zhèn)靜催眠和抗抑郁［9-10］， 保護(hù)肝臟［11］， 抗動(dòng)脈粥樣硬化12］等多種生物學(xué)活性。

菟絲子臨床主要以炮制品入藥，古代對(duì)菟絲子的炮制方法主要有炒制、鹽炙、制餅、酒炙、酒蒸等，現(xiàn)代主要有鹽炙、 炒黃等［13］。 《中國(guó)藥典》 2010 年版收載了生菟絲子和鹽菟絲子。菟絲子經(jīng)鹽炙后可增強(qiáng)其補(bǔ)肝腎作用，但其鹽炙增效機(jī)理至今尚不明確。菟絲子鹽炙后金絲桃苷量降低， 而槲皮素量升 高［14］。 曾誠(chéng)等［15］研 究 了菟絲子 灌 胃后大鼠血漿中槲皮素的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律。但炮制對(duì)菟絲子中槲皮苷的體內(nèi)吸收代謝有何影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用HPLC-UV法測(cè)定菟絲子生品與鹽炙品提取物大鼠給藥前及灌胃后不同時(shí)間點(diǎn)槲皮苷的血藥濃度，并計(jì)算有關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，比較菟絲子生品與鹽炙品在體內(nèi)的吸收和代謝差異，為進(jìn)一步闡明菟絲子的炮制原理及臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 日立 L-2000 型高效液相色譜儀 (日本日立)；FA1604N型電子天平 (精密度為十萬(wàn)分之一， 上海精密科學(xué)儀器有限公司)； KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器 ( 江蘇昆山市超聲儀器有限公司)； PM PLUS 型紅外測(cè)溫儀 (美國(guó) Raytek 公司)； RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 ( 上海亞榮生化儀器廠)； H-1850D臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) ( 湘儀離心機(jī)儀器有限公司)； XK96-B快速混勻器 ( 姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試劑和試藥 菟絲子購(gòu)自亳州市成源中藥飲片有限公司，產(chǎn)地為山東省，經(jīng)本校中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定為旋花科植物 菟 絲 子 Cuscuta chinensis Lam.的 干燥成熟種子。 槲皮苷對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所， 批號(hào)為111538-200504， 供含量測(cè)定用)； 高效液相用甲醇 ( 色譜純)； 娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 健康 SD大鼠， 雌雄不限， 體質(zhì)量 (200 ±20) g， 由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供 ( 許可證號(hào):scxk 魯20080002)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菟絲子炮制品的制備 生菟絲子: 取原藥材， 揀去雜質(zhì)和殘留的果梗。 鹽菟絲子: 取凈菟絲子 50 g， 加 10%食鹽水溶液 10 mL， 拌勻， 悶潤(rùn) 1 h， 置熱鍋內(nèi)， 180 ℃ (用紅外測(cè)溫儀測(cè)定鍋底溫度) 炒制 7m in， 取出， 放涼。 成品表面棕黃色， 微有裂口， 氣微香， 符合 《中國(guó)藥典》 2010年版鹽菟絲子的性狀要求。

2.2 灌胃藥液的配制 分別稱(chēng)取菟絲子生品與鹽炙品各50 g， 分別加 10、 10、 10 倍量 80%乙醇超聲提取 3 次， 每次 1 h， 濾過(guò)， 合并濾液， 減壓濃縮至每 1 mL相當(dāng)于 2.5 g生藥，置4℃冰箱保存，備用。

2.3 給藥和血樣采集 取健康 SD大鼠 12 只， 隨機(jī)分為 2組，即生菟絲子組和鹽菟絲子組，每組6只，給藥前禁食12 h， 自由飲水。 灌胃給予菟絲子生品和鹽炙品提取液(給藥劑量: 生品提取液相當(dāng)于槲皮苷 32.13 mg/kg， 鹽炙品提取液相當(dāng)于槲皮苷 33.39 mg/kg)。 分別于給藥前及給藥后 5、 15、 30、 60、 90、 120、 180、 240、 360 m in 經(jīng)大鼠眼眶后靜脈叢取血， 每次 0.5mL， 置于 1mL肝素化的離心管中， 離心 10 min(4 000 r/min) ， 分離血漿， 置 -20 ℃冰箱保存，備用。

2.4 測(cè)定血漿中槲皮苷 HPLC-UV法的建立

2.4.1 色 譜 條 件［16］KromasiL C18色 譜 柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm)； 流動(dòng)相為 0.1% 磷酸水-甲醇 (60 ∶40)； 體積流量為 1.0 mL/min； 柱溫 30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng) 350 nm； 進(jìn)樣量 20 μL。

2.4.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取槲皮苷對(duì)照品 1.48 mg， 加甲醇溶解并稀釋至 10 mL量瓶中， 得到對(duì)照品原貯備液 148 μg/mL， 將該貯備液稀釋成 14.8 μg/mL的溶液，即得。

2.4.3 血漿樣品的前處理及分析 取給藥前及給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠血漿各 200 μL， 加入甲醇 800 μL沉淀蛋白，渦旋混勻 3min， 12 000 r/min 離心 10min， 取上清液備用。精密吸取上述上清液各 20 μL， 注入液相色譜儀， 色譜圖見(jiàn)圖1。 結(jié)果空白血漿樣品在待測(cè)成分保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，含藥血漿樣品各色譜峰分離良好。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液 2、 10、 20、40、 100、 200、 400 μL， 置 10 mL具塞離心管中， 37 ℃空氣流吹干， 再分別精密加入空白血漿 200 μL， 配制成相當(dāng)于槲 皮苷質(zhì) 量濃度為 0.148、 0.74、 1.48、 2.96、 7.40、14.80、 29.60 μg/mL的血漿樣品。 按照 “2.4.3” 項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，分別記錄峰面積。以血藥質(zhì)量濃度(μg/mL) 為橫坐標(biāo)， 以峰面積為縱坐標(biāo)， 用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得槲皮苷線性回歸方程 Y= 6 179.6X+62.041(r=0.997 0)， 線性范圍為0.148 ～29.6 μg/mL， 定量下限為 0.148 μg/mL。

圖1 空白血漿 （A）、 空白血漿加槲皮苷對(duì)照品 （B）、 含藥血漿 （C） HPLC圖

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取大鼠空白血漿 200 μL， 按“2.4.4” 項(xiàng)下的方法制備高、 中、 低 3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品 (29.6、 2.96、 0.148 μg/mL)， 每個(gè)質(zhì)量濃度的樣品制備 6 份， 按 “2.4.3” 項(xiàng)下方法處理， 當(dāng)天對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定， 評(píng)價(jià)日內(nèi)精密度。 重復(fù)測(cè)定3 d， 以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定血漿樣品的質(zhì)量濃度，評(píng)價(jià)日間精密度，結(jié)果日內(nèi)精密度 RSD分別為 4.9%、 2.2%、 1.9%， 日間精密度 RSD分別為 5.3%、 5.1%、 3.7%。

2.4.6 穩(wěn) 定 性 試 驗(yàn) 取 大 鼠 空 白 血 漿 200 μL， 按“2.4.4” 項(xiàng)下的方法制備高、 中、 低 3 個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)的血漿樣品 (29.6， 2.96， 0.148 μg/mL)， 每個(gè)質(zhì)量濃度的樣品制備 6 份， 按 “2.4.3” 項(xiàng)下方法處理， 室溫下放置， 于制備后 0、 2、 4、 8、 10、 12 h 進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算 RSD值， 3個(gè)質(zhì)量濃度的 RSD值分別為 3.60%、 2.04%、 2.43%， 表明標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品室溫放置12 h穩(wěn)定性良好。

2.4.7 回收率試驗(yàn) 精密吸取大鼠空白血漿 200 μL， 按“2.4.4” 項(xiàng)下的方法制備高、 中、 低 3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品， 每個(gè)質(zhì)量濃度的樣品制備 6 份， 按 “2.4.3” 項(xiàng)下方法處理，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算槲皮苷量，測(cè)得值與理論值相比得相對(duì)回收率， 結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 菟絲子生、 制品中槲皮苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算及結(jié)果 將測(cè)得的血藥質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)運(yùn)用 DAS 2.1 軟件按照非室模型進(jìn)行擬合計(jì)算，結(jié)果表明，大鼠灌胃給予生、鹽菟絲子提取物后槲皮苷在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)過(guò)程符合二室模型；槲皮苷在大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2， 其平均血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖 2。

3 小結(jié)與討論

3.1 通過(guò) DAS 2.1 軟件房室模型分析， 生菟絲子、 鹽菟絲子提取物灌胃后大鼠血漿中槲皮苷的吸收代謝過(guò)程均符合二室模型。分析藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，大鼠灌服菟絲子生、制品提取物后， 槲皮苷藥時(shí)曲線下面積 AUC(0-t)、 AUC(0-∞)、達(dá)峰濃度 Cmax， 均為鹽炙品 ＞生品， 鹽炙品與生品比較，有顯著性差異，說(shuō)明鹽炙能促進(jìn)槲皮苷的吸收。消除半衰期 t1/2z: 鹽炙品 ＞生品， 鹽炙品與生品比較， 有顯著性差異，說(shuō)明鹽炙能延緩槲皮苷在體內(nèi)的消除。

表1 大鼠血漿中槲皮苷的相對(duì)回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 菟絲子生品與鹽炙品灌胃后槲皮苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 （ n=6， ˉ）

表2 菟絲子生品與鹽炙品灌胃后槲皮苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 （ n=6， ˉ）

注: 鹽炙品與生品比較，*P＜0.01； 相對(duì)生物利用度 F= AUC(0-t)鹽· D生/AUC0-t)生· D鹽×100%=152.30%， D為 給 藥劑量

參數(shù)單位生菟絲子鹽菟絲子AUC(0-t)μg·mL-1·h10.419 ±0.37616.485 ±0.351*AUC(0-∞)μg·m L-1·h10.745 ±0.39318.354 ±0.715*AUMC(0-t)μg·m L-1·h218.108 ±0.76629.822 ±1.109 AUMC(0-∞)μg·m L-1·h220.618 ±1.18646.406 ±6.746 MRT(0-t)h1.738 ±0.0171.809 ±0.052 MRT(0-∞)h1.918 ±0.0652.521 ±0.283 VRT(0-t)h?21.564 ±0.0642.244 ±0.133 VRT(0-∞)h?22.653 ±0.4127.325 ±2.096 t1/2zh1.157 ±0.1561.914 ±0.299*Tmaxh0.50.5 Cmaxμg·mL-15.398 ±0.20211.465 ±0.274*

圖2 菟絲子生品與鹽炙品提取物中槲皮苷平均藥時(shí)曲線比較 （ n=6， ˉ）

3.2 前期曾采用 HPLC法測(cè)定菟絲子生品與鹽炙品粉末(4 號(hào) 篩) 中槲皮 苷， 結(jié) 果 生 品 為 0.056%， 鹽 炙 品 為0.030%， 鹽炙后槲皮苷量降低 46.56%， 測(cè)定菟絲子生品與鹽炙品 80%乙醇提取物中槲皮苷提取量， 結(jié)果生品為0.040%， 鹽炙品為 0.042%， 說(shuō)明鹽炙利于成分的煎出。本實(shí)驗(yàn)在菟絲子生品與鹽炙品提取物中槲皮苷量相近的情況下，比較菟絲子鹽炙品與生品中槲皮苷的生物利用度，結(jié)果鹽炙品約為生品的 1.5 倍， 說(shuō)明鹽炙可提高菟絲子中槲皮苷的生物利用度，為菟絲子鹽炙增效提供了科學(xué)依據(jù)。

3.3 曾對(duì)菟絲子炮制品提取物中金絲桃苷進(jìn)行測(cè)定， 由于金絲桃苷主要存在于菟絲子種仁里，提取物中金絲桃苷量很低， 在給藥劑量80 g/kg時(shí)， 大鼠血漿中仍未檢出金絲桃苷色譜峰，故未對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

［ 1 ］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］.北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010:291.

［2］ 葉 敏，閻玉凝，喬 梁，等.中藥菟絲子化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志， 2002， 27(2):115-117.

［3］ 謝雁鳴，秦林林，于向東，等.骨碎補(bǔ)、淫羊藿、菟絲子總黃酮對(duì)成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)影響的比較研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志， 2005， 12(7):22-23.

［4］ 劉玉平， 魏曉東， 歐 芹， 等.菟絲子對(duì) D2半乳糖致衰老大鼠非酶糖基化及自由基的抑制作用研究［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)， 2006， 29(2):122.

［5］ 顧立剛，葉 敏，閻玉凝，等.菟絲子金絲桃苷體內(nèi)外對(duì)小鼠免疫細(xì)胞功能的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息， 2001， 8 (11):42-44.

［6］ 王建紅，王敏章，歐陽(yáng)棟，等.菟絲子黃酮對(duì)應(yīng)激雌性大鼠下丘腦 β2EP與腺垂體 FSH、 L H 的影響［J］.中藥材，2002， 25(12):886-887.

［7］ 王曉敏，王建紅，伍慶華，等.菟絲子黃酮對(duì)去勢(shì)雌性大鼠血清雌激素水平和血管平滑肌細(xì)胞的影響［J］.天津醫(yī)藥， 2005， 33(10):41-43.

［ 8 ］ Chou S C， Su C R， Ku Y C， et al.The constituents and Their Bioactivities of Houttuynia cordata［ J］ .Pharm Society Jpn， 2009， 57(11):1227-1230.

［9］ 劉珊珊.槲皮苷和熊果酸對(duì)睡眠內(nèi)源性物質(zhì)影響的研究［D］.哈爾濱: 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)， 2008.

［10］ 向 春.合歡花品種品質(zhì)研究［D］.成都: 成都中醫(yī)藥大學(xué)， 2006.

［11］ 劉 麗， 侯立強(qiáng)， 滿 瑩.槲皮苷對(duì)撲熱息痛誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究［J］.藥物與臨床， 2007， 45 (10):98-116.

［12］ Choi JB， Bae JY， Kim D S， et al.Dietary compound quercitrin dampens VEGF inducition and PPARgamma activation in oxidized LDL-exposed murine macorphages:association with scavenger receptor CD36 ［ J］ .J Agricult Food Chem， 2010，58(2):1333-1334.

［13］ 金世元， 王 琦.中藥飲片炮制研究與臨床應(yīng)用［M］.北京: 化學(xué)工業(yè)出版社， 2004:619-620.

［14］ 楊青月， 張學(xué)蘭， 惠秋莎， 等.菟絲子不同炮制品 3 種黃酮類(lèi)成分比較［J］.中成藥， 2011， 11(33):1947-1949.

［15］ 曾 誠(chéng)， 宓穗卿， 羅頌平， 等.菟絲子中槲皮素藥代動(dòng)力學(xué)研 究 ［ J］.中 藥 新 藥 與 臨 床 藥 理， 2004， 15(1): 1046-1048.

［16］ 鄭一敏， 胥秀英， 傅善權(quán)， 等.高效液相色譜法測(cè)定金錢(qián)草中槲皮苷含量［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志， 2004， 23 (2):144-146.

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:1001-1528(2014)02-0401-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.044

2013-02-18

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)-“重大新藥創(chuàng)制” -“山東省重大新藥創(chuàng)制中心建設(shè)” (2009ZX09301-013)

王 莉 (1987—) ， 女， 碩士生， 主要從事中藥炮制與中藥新藥研發(fā)。 Tel:15064148485， E-mail:wangliwl1987@126.com

*通信作者: 張學(xué)蘭 (1963—) ， 女， 教授， 碩士， 主要從事中藥炮制與中藥新藥研發(fā)。 Tel:13406062766， E-mail:zhang8832440@sina.com

日期:2013-10-23

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