HPD-300 大孔吸附樹脂對山茱萸總皂苷分離工藝的優化

趙惠茹， 龍 靜， 楊黎彬， 邊軍昌

（西安醫學院藥學院， 陜西 西安 710021）

HPD-300 大孔吸附樹脂對山茱萸總皂苷分離工藝的優化

趙惠茹， 龍 靜， 楊黎彬， 邊軍昌

（西安醫學院藥學院， 陜西 西安 710021）

目的 研究大孔吸附樹脂對山茱萸總皂苷分離的最佳工藝。方法 通過比較山茱萸總皂苷在9種不同型號大孔樹脂上的吸附與解吸性能篩選最佳樹脂，應用單因素分析和正交試驗的方法對所選最佳樹脂純化山茱萸總皂苷的工藝參數進行優化。 結果 HPD-300 型大孔樹脂具有良好的吸附與解吸性能， 確定的分離工藝參數為: 上樣溶液質量濃度為 0.5 g/mL， 樹脂柱徑高比為 1 ∶7， 吸附體積流量為 2 BV/h， 每克干樹脂的最大吸附量為 1.125 g生藥。 吸附飽和后， 先用 3 BV蒸餾水洗脫去除水溶性雜質， 再用 3.5 BV 50%乙醇進行解吸附， 純化后的山茱萸總皂苷保留率和精制度分別為 92.6%和 394.5%。 結論 HPD-300 型大孔樹脂可作為純化山茱萸總皂苷的較佳分離材料， 經過優化的分離工藝穩定可靠，可在工業化生產中應用。

大孔樹脂；山茱萸；總皂苷

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸 Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉， 性溫、 味酸， 具有補肝腎、 澀精氣、 固虛脫的功效［1］。 其 化學成分主 要含有環烯醚萜苷類、 皂苷、 多糖、 熊果酸、 齊墩果酸、 鞣質等［2-3］。 近代藥理學研究發現，山茱萸具有抑菌抗病毒，調節人體免疫功能，降血糖和抗衰老等作用，山茱萸總皂苷有明顯的免疫抑制活性［4-5］。 大孔吸附樹脂作為一種選擇性吸附劑， 具有吸附和解吸速度快、吸附容量大、容易再生、使用壽命長等優點， 現已被廣 泛應用 于皂苷 的分離和 富 集［6-11］。 但在山茱萸總皂苷分離方面只有初步研究［12-14］， 現有文獻并未對大孔吸附樹脂的分離純化工藝進行系統全面的報道。為了獲得最佳分離工藝參數，本實驗比較了9種大孔樹脂對山茱萸總皂苷的吸附和解吸性能，篩選出效果最佳的樹脂型號。以純化后山茱萸樣品中總皂苷含量為指標，通過單因素分析和正交試驗的方法對影響吸附和解吸附過程的主要因素進行了綜合考察，以期為開發和利用山茱萸總皂苷提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀 器 UV-160A型 紫 外分光光 度 計 ( 日 本 島津)；DZKW-D-2 型智能數顯恒溫水浴箱 (北京市永光明醫療儀器廠) ； BP211D型 精 密 電 子 天 平 ( 德 國 Sartorius公 司)；旋轉蒸發儀 (上海亞榮生化儀器廠)； SHZ-D循環水式真空泵 (河南鞏義市英峪予華儀器廠)； DHG 9000 系列電熱恒溫鼓風干燥箱 (上海安亭科學儀器有限公司)。

1.2 材料 山茱萸藥材 (產地為陜西洋縣) 經本實驗室楊黎彬 博 士 鑒 定 為 山 茱 萸 科 植 物 山 茱 萸 (Cornus officinalis Sieb.et Zucc.) 的成熟果肉； 人參皂苷 Re對照品 ( 中國藥品生物制品檢驗所)； 大孔吸附樹脂 HPD-722、 NKA-9、AB-8、 HPD-600、 S-8、 HPD200A、 DM-130、 NKA-Ⅱ、HPD-300 均購自陜西藍深科技有限公司； 甲醇 (色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 人參皂苷的測定

2.1.1 標準曲線的繪制 精密稱取人參皂苷 Re對照品6.1 mg， 加適量甲醇溶解并定容至 5 mL， 精密吸取 10、15、 20、 25、 50 μL于具塞試管中， 揮干溶劑， 精密加入新鮮配制的 5%香草醛-冰醋酸溶液 0.2 m L、 高氯酸 0.8 mL，振搖混 勻后 于 65 ℃ 水浴加熱 20 min， 取 出， 冰 水 冷 卻2 min后， 加冰醋酸 5 mL搖勻， 隨行試劑空白， 以精密吸取 20 μL對照品的溶液在 400 ～800 nm范圍內掃描， 測得人參皂苷 Re的最大吸收波長為 554 nm， 故選擇 554 nm為測定波長。 以吸光度 A為縱坐標， 人參皂苷 Re質量濃度 C為橫坐標， 繪制標準曲線， 計算得回歸方程:A=22.045C +0.134 5， r=0.998 9， 線性范圍為 12.2 ～61 μg。

2.1.2 山茱萸總皂苷測定 吸取待測山茱萸樣品液一定量， 水浴揮干， 按照 “2.1.1” 項下方法自 “精密加入新配制的 5%香草醛-冰醋酸溶液 0.2 mL” 起， 依法測定吸收度，并用回歸方程計算即得。

2.2 山茱萸樣品溶液的制備 稱取干燥粉碎后的山茱萸粗粉 (40 目)， 加 10 倍量70%乙醇回流提取 3 次， 每次 2 h，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，加6倍量蒸餾水冰箱冷藏過夜，離心，上清液減壓濃縮得質量濃度為1.0 g生藥/mL的山茱萸上樣原液， 備用。

2.3 大孔吸附樹脂預處理［15］根據山茱萸中所含有效成分的理 化 性 質 和 大 孔樹 脂 的 吸附 性 能， 選 用 HPD-722，NKA-9， AB-8， HPD-600， S-8， HPD200A， DM-130， NKA-Ⅱ， HPD-300 共 9 種型號的大孔樹脂分別用 95%乙醇室溫浸泡 24 h， 傾去上層乙醇， 濕法裝柱， 繼續用 95%乙醇以1.5 BV/h 的體積流量過柱， 至流出液加 5 倍量水不產生白色渾濁為止， 用去離子水沖洗至中性， 然后用3 BV 5%HCl溶液浸泡2 h后用去離子水洗至流出液呈中性， 再用3 BV 5%NaOH溶液浸泡 2 h， 最后用足量的去離子水洗至流出液呈中性，備用。

2.4 大孔吸附樹脂型號篩選 精密稱取處理后的 9 種大孔吸附樹脂各 5 g， 分別置于 9 只 50 mL具塞錐形瓶中， 用吸量管精密加入上柱溶液 20 mL， 每隔 10 min 振搖 20 s， 持續 2 h。 靜置 24 h 后， 過濾， 得吸附后濾液。 測定吸光度，代入回歸方程求出濾液中山茱萸總皂苷質量濃度，計算比吸附量和吸附率。 將過濾后的樹脂另置 50 mL具塞錐形瓶中， 分別精密加入 50%乙醇 20mL， 每隔 10min 振搖 20 s，持續2 h， 靜置8 h后， 濾過， 同法測定濾液中總皂苷質量濃度， 計算比解吸量和解吸率，結果見表1。

表1 9種大孔吸附樹脂對山茱萸總皂苷吸附與解吸性能

由表 1 可見 AB-8 型大孔樹脂的吸附率和解吸率分別為82.5% 和 77.1%， HPD-300 型大孔樹脂的吸附率和解吸率分別為 88.7% 和 76.2%， 均高于其他 7 種型號樹脂。 雖然HPD-300 型大孔樹脂的解吸率低于 AB-8 型大孔樹脂 0.9%，但是吸附率高出 6.2%， 故選擇 HPD-300 型大孔樹脂分離純化山茱萸總皂苷。

2.5 HPD-300 型大孔樹脂對山茱萸總皂苷吸附的影響因素考察

2.5.1 藥液質量濃度、 樹脂柱徑高比及吸附體積流量 根據預實驗結果，藥液質量濃度、樹脂柱徑高比、吸附體積流量對吸附影響較大。因此采用正交試驗法，所選因素為藥液質量濃度、樹脂柱徑高比、吸附體積流量，每個因素選擇 3 個水平， 按照 L9(34) 正交表安排試驗， 以大孔樹脂對山茱萸總皂苷的比吸附量為指標進行評價，確定最佳吸附條件， 結果見表2 ～4。

表2 正交試驗因素水平

表 3 L9（34） 正交試驗結果

表4 方差分析結果

由表3可以看出，各因素對吸附條件的影響程度依次為B＞C＞A。 方差分析表明， 因素A對實驗結果的影響不顯著，因素B和C均有顯著性差異。因此，確定最佳水平組合為 A3B1C2， 即藥液質量濃度為 0.5 g生藥 /mL， 樹脂柱徑高比 1 ∶7， 吸附體積流量為 2 BV/h。

2.5.2 飽和吸附量 取 20 g HPD-300 型大孔吸附樹脂裝于色譜柱 (20 mm×300 mm) 中， 在上述優化條件下， 取 100 m L山茱萸上柱藥液加入到樹脂床中， 按照每流份5 mL等體積收集吸附后的流出液， 共收集 20 份。 按照 “2.1.2”項方法測定每個流份的吸光度，代入回歸方程求出總皂苷質量濃度。以收集的流份編號為橫坐標，總皂苷質量濃度為縱坐標，繪制泄露曲線， 見圖1。

圖 1 山茱萸總皂苷在 HPD-300 型大孔樹脂上的泄露曲線

由試驗結果可知， 流份 10中總皂苷質量濃度是流份 9的 8.7 倍， 即樹脂柱出現泄漏現象， 此時樣品總上柱體積為 45mL， 相當于含有 22.5 g生藥， 因此確定 HPD-300 型大孔樹脂的飽和吸附量為每克樹脂吸附 1.125 g生藥。

2.6 HPD-300 型大孔樹脂對山茱萸總皂苷解吸附的影響因素考察

2.6.1 解吸溶劑質量濃度 取 100 mL山茱萸總皂苷樣品溶液 (0.5 g生藥/mL)， 以 2 BV/h 的體積流量通過裝有20 g HPD-300 型大孔樹脂的色譜柱 (20 mm×300 mm)， 待充分吸附后， 先用 水洗至流出液 molish 反應 呈陰性， 依次用10%、 30%、 50%、 70%和 90%乙醇以1 BV/h 的體積流量進行梯度洗脫，每種質量濃度的洗脫液各收集5份，每份10mL， 測定其中總皂苷的質量濃度， 以流份編號為橫坐標， 質量濃度為縱坐標， 繪制洗脫曲線，結果見圖2。

圖2 不同質量濃度解吸溶劑的考察

由洗脫曲線可見山茱萸總皂苷主要集中在 50%乙醇洗脫液中， 占全部醇洗脫液中山茱萸總皂苷的 79.7%。 由于50%乙醇具有良好的解吸附能力， 而水和 90%乙醇洗脫部分基本不含皂苷，因此洗脫時，先用蒸餾水洗去糖類等水溶性雜質， 再用 50%乙醇洗脫總皂苷。

2.6.2 洗脫體積流量 在上述優化條件下， 裝 4 根 HPD-300 型大孔樹脂柱 (20mm×300mm)， 用 50%乙醇分別以1、 2、 3、 4 BV/h 體積流量進行洗脫， 各收集 8 倍量洗脫液，測定洗脫液的吸光度，代入回歸方程求出總皂苷質量濃度， 計 算 解 吸 率。 解 吸 率 分 別 為 93.2%、 91.6%、85.3%、 76.5%， 結果可見體積流量越慢， 解吸率越高。當體積流量為 2 BV/h 時， 解吸率比體積流量 1 BV/h 稍小，但是可以縮短一半洗脫時間，考慮到生產效率，最后選擇2 BV/h 為洗脫體積流量。

2.6.3 解吸溶劑最佳用量 取 100 mL山茱萸總皂苷樣品溶液 (0.5 g生藥/mL)， 在上述優化條件下進行試驗， 吸附完全后， 先用 3 BV水洗脫至流 出液 molish 反應呈陰 性，再用50%乙醇洗脫， 等體積收集乙醇洗脫液15 份， 每份10 m L。 按照 “2.1.2” 項方法測定每個流份的吸光度， 計算總皂苷的質量濃度，以流份編號為橫坐標，質量濃度為縱坐標， 繪制洗脫曲線， 見圖3。

圖 3 山茱萸總皂苷在 HPD-300 型大孔樹脂上的洗脫曲線

由圖3可知， 流份10中總皂苷的質量濃度非常低， 可見大孔樹脂柱中吸附的山茱萸總皂苷已基本解吸完全，此時溶劑用量為 100 mL。 因此確定 50% 乙醇最佳用量為3.5 BV。

2.7 工藝驗證試驗 按照 “2.2” 項方法制備 30 mL質量濃度為 0.5 g/mL的山茱萸樣品溶液， 用 HPD-300 型大孔樹脂裝柱，按照最佳吸附條件充分吸附后， 先用3 BV蒸餾水洗脫至流出液 molish 反 應 呈 陰 性， 再 用 3.5 BV 50% 乙 醇 洗脫，收集乙醇洗脫液。分別測定樣品溶液和經過大孔樹脂柱后 50%乙醇洗脫液的吸光度， 代入回歸方程求出總皂苷質量濃度，按經過大孔樹脂純化后山茱萸總皂苷質量與未經處理的樣品溶液中山茱萸總皂苷質量之比計算純化保留率。 同法重復3次試驗， 結果見表5。

表5 山茱萸總皂苷純化保留率

從表 5 得知， 山茱萸總皂苷經過 HPD-300 型大孔樹脂純化后的平均保留率為 92.6%。 結果表明， 在應用該大孔樹脂純化時，山茱萸總皂苷損失很少。

2.8 精制度試驗［16］按照 “2.2” 項方法制備 60 mL質量濃度為 0.5 g/mL的山茱萸樣品溶液， 等體積分成兩份， 一份在上述優化條件下進行大孔樹脂純化試驗， 得到 50%乙醇洗脫液，另一份為樣品原液，將這兩種溶液分別減壓濃縮、干燥后得到浸膏，測定總皂苷的含量，按照經過大孔樹脂純化后洗脫液固形物中總皂苷含量與樣品原液固形物中總皂苷含量之比計算精制度。同法重復3次試驗。結果可見， 樣品溶液經過 HPD-300 型大孔樹脂后， 精制度分別為 402.3%、 394.7%、 386.5%， 說明該工藝實驗條件穩定，對山茱萸總皂苷有較好的富集純化作用。

3 討論

3.1 采用單因素分析和正交試驗的方法對 HPD-300 型大孔樹脂純化山茱萸提取液中總皂苷的工藝條件進行優選，在藥液質量濃度為0.5 g/mL， 每克樹脂的吸附量為1.125 g生藥， 吸附體積流量為 2 BV/h， 樹脂柱的徑高比為 1 ∶7 的條件下， 吸附效果最好； 以 3.5 BV 50%乙醇洗脫， 洗脫體積流量為 2 BV/h， 總皂苷 保留率為 92.6%， 精制度可達394.5%， 說明該樹脂分離純化山茱萸總皂苷是可行的。

3.2 曾有文獻［13］報道水洗脫部位經薄層鑒別含有皂苷，但本實驗發現水只能洗脫除去糖類等極性較大的雜質，對總皂苷基本沒有洗脫， 而 30%乙醇洗脫的總皂苷占全部醇洗脫液中總皂苷的 14.7%， 山茱萸總皂苷主要集中在 50%乙醇洗脫液中。因此經吸附飽和的樹脂，先用蒸餾水洗至流出液 molish 反應呈陰性， 再用 50%乙醇 洗脫總皂苷， 此工藝溶劑用量少，洗脫效果好。

3.3 由于山茱萸皂苷與香草醛-冰醋酸試劑的顯色反應受溫度、顯色時間等因素的影響較大，因此在實驗中應嚴格控制顯色時間和反應溫度，尤其在加入醋酸和測定吸光度之前，樣品一定要置于冰水浴中，并及時測定，否則將會產生較大的實驗誤差。

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R284.2

:B

:1001-1528(2014)02-0416-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.048

2013-02-20

陜西省中醫藥管理局科研計劃項目 (ZY04)

趙惠茹 (1972—) ， 女， 碩士， 副教授， 主要從事天然藥物研究與開發。 E-mail:wang-gq@chd.edu.cn