肉豆蔻中總木脂素的提取工藝優(yōu)化研究

袁子民， 王 靜， 胡 娜， 賈天柱， 劉 歡

（遼寧中醫(yī)藥大學， 遼寧 大連 116600）

肉豆蔻中總木脂素的提取工藝優(yōu)化研究

袁子民， 王 靜， 胡 娜， 賈天柱*， 劉 歡

（遼寧中醫(yī)藥大學， 遼寧 大連 116600）

目的 優(yōu)選提取肉豆蔻總木脂素的最佳提取工藝。方法 以肉豆蔻總木脂素提取量為評價指標結(jié)合正交試驗，優(yōu)化其提取工藝。 結(jié)果 分別采用 10 倍量和 8 倍量 90%乙醇為溶媒提取 2 次， 每次 1.5 h。 結(jié)論 本工藝穩(wěn)定， 重復性良好，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

肉豆蔻；總木脂素；正交試驗

肉豆蔻為臨床常用中藥， 載于 《中國藥典》 2010 年版， 為肉豆蔻 科 植 物肉豆蔻 Myristica fragrans Houtt.的 干燥成熟種仁， 具有行氣、 止瀉等藥理作用［1］。 化學成分主要含有揮發(fā)油、脂肪油、木脂素和苯丙素等。其中木脂素類主要成分為肉豆蔻木脂素、 去氫二異丁香酚、 利卡啉-B等［2-4］， 現(xiàn)代藥理研究表明肉豆蔻總木脂素類成分可能具有抗氧化、 保肝、 抗炎、 抗腫瘤等作用［5］。 為對木脂素類成分的藥理作用深入研究，本實驗以肉豆蔻總木脂素提取量為評價指標，采用正交試驗法，對其總木脂素提取工藝進行優(yōu)化研究［6-8］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 U-3010 紫外 可見分 光光度計 ( 日本日立公司)； 數(shù)顯恒溫水浴鍋 (江蘇省金壇市榮華儀器廠)；AR2140 型電子分析天平 (上海奧豪斯公司)。

1.2 試藥 肉豆蔻藥材市售 (浙江中醫(yī)藥大學飲片廠， 產(chǎn)地: 印度尼西亞， 批號 090414)； 去氫二異丁香酚對照品(中國食品藥品檢定研究院， 批號 11838-201102)； 乙醇、甲醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝的正交試驗設(shè)計 由于肉豆蔻中木脂素類成分的脂溶性較強， 因此本實驗乙醇體積分數(shù) (A)、 溶媒用量 (B)、 浸提次數(shù) (C)、 時間 (D) 四個因素、 三個水平進行試驗考察， 采用 L9(34) 正交試驗設(shè)計表 (見表 1)，實驗結(jié)果見表2。

2.2 方法及工藝評價指標 取肉豆蔻粉末 (過 20 目篩) 30.0 g， 精密稱定， 共 9 份樣品。 按正交試驗表 2 進行實驗， 合并各實驗提取液， 靜置 24 h， 濾過， 濾液置 1 000 mL量瓶中， 加相應(yīng)乙醇體積分數(shù)提取溶劑稀釋至刻度， 搖勻，備用。以肉豆蔻總木脂素提取量為考察指標，結(jié)果列入表2。

表 1 L9（34） 因素水平

表 2 L9（34） 正交試驗表設(shè)計及結(jié)果

2.3 總木脂素的測定方法

2.3.1 標準曲線的制備 取去氫二異丁香酚對照品 15.0 mg， 精密稱定， 置100m L量瓶中， 加甲醇溶解并稀釋至刻度， 搖勻作為貯備液。 分別精密量取貯備液 0.1、 0.2、0.3、 0.4、 0.5、 0.6 mL， 置 10 mL量瓶中， 分別加甲醇至刻度， 搖勻， 制成每 1mL含去氫二異丁香酚為 1.5、 3.0、4.5、 6.0、 7.5、 9.0 μg/mL的標準液， 以甲醇為空白， 在275 nm波長處測定吸光度。 以吸光度為縱坐標， 質(zhì)量濃度為橫坐標， 繪制標準曲線。 其回歸方程為 Y=0.090 5X+ 0.004 2(r=0.999 8)。 結(jié)果去氫二異丁香酚濃度在 1.5 ～9.0 μg/mL范圍內(nèi)， 線性關(guān)系良好。

2.3.2 供試品溶液制備 取 “2.2” 項下 1 000 mL量瓶中的樣品溶液， 分別精密量取 1.0 mL， 蒸干， 殘渣加甲醇溶解， 轉(zhuǎn)移置 100 mL量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度， 搖勻，即得。

2.3.3 精密度試驗 取同一供試品溶液， 于 275 nm處重復 測 定 6 次 吸 光 度， 結(jié) 果 精 密 度 試 驗 良 好， RSD為 0.92%。

2.3.4 重復性試驗 分別精密量取同一樣品溶液各 6 份，按 “2.3.2” 項方法操作， 以甲醇為空白， 于 275 nm波長處測定吸光度， 結(jié)果重復性良好， RSD為 1.5%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液， 以甲醇為空白，于 275 nm波長處分別在 0、 2、 4、 6、 8 h 測定吸光度， 結(jié)果供試品溶液在 8 h 內(nèi)穩(wěn)定， RSD為 2.3%。

2.3.6 回收率試驗 分別精密量取 6 份已知含量 (0.291 mg/m L) 的供試品液 0.5 mL， 分別精密加入去氫二異丁香酚對照 品 溶 液 (0.15 mg/mL)1.0 mL， 蒸干， 其 余 按“2.3.2” 項下的供試品溶液制備方法操作， 以甲醇為空白，測定吸光度，并計算回收率。結(jié)果平均回收率為98.3%， RSD為 2.4%。

2.3.7 正交試驗樣品總木脂素測定 取正交試驗項下的各供試品溶液， 以甲醇為空白， 于 275nm波長處測定吸光度， 由回歸方程計算總木脂素提取量， 結(jié)果見表2。

2.4 結(jié)論 由方差分析表 3 可知， A因素對提取工藝有顯著性影響，其它因素影響均不顯著。經(jīng)直觀分析，影響提取工藝的主要因素依次為 A＞C＞D＞B， 最佳提取條件為A3B2C2D2。 即采用 90%乙醇為溶媒， 提取 2 次， 第 1 次加入 10 倍量， 第 2 次加入 8 倍量， 每次提取 1.5 h。

表3 方差分析

2.5 工藝驗證 為保證該工藝的重復性、 可行性， 本實驗在正交試驗的基礎(chǔ)上，按確定的最佳提取工藝，進行3次工藝驗證實驗， 實驗用藥量為 30.0 g， 結(jié)果肉豆蔻中總木脂素提取量分別為 369.1、 365.8、 358.7 mg， 平均值為364.5 mg。 結(jié)果表明該工藝基本穩(wěn)定可靠。

3 討論

3.1 測定波長的選擇 將對照品溶液、 供試品溶液分別在200 ～400 nm進行掃描， 結(jié)果對照品溶液、 供試品溶液均在 275 nm處有最大吸收， 因此選擇 275 nm為紫外測定波長。

3.2 供試品溶液制備方法的選擇 由于肉豆蔻中肉豆蔻醚、黃樟醚、甲基丁香酚等揮發(fā)油類成分均含有苯丙素類結(jié)構(gòu)， 在紫外 275 nm處也有吸收， 因此為去除揮發(fā)油類成分的干擾，對供試品溶液的制備進行了篩選。 方法1: 精密吸取正交 1 號樣品 1.0 mL， 置蒸發(fā)皿中， 水浴蒸干， 殘渣加適量水， 多次分散轉(zhuǎn)移， 置離心試管中， 離心 30 min (4 000 r/min)， 上清液棄去， 沉淀物加甲醇溶解， 轉(zhuǎn)移置100mL量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 得供試品溶液1； 方法 2: 精密吸取正交 1 號樣品 1.0 m L， 置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干， 殘渣加甲醇溶解， 轉(zhuǎn)移置 100 mL量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 得供試品溶液 2； 同時另精密吸取正交 1 號樣品 1.0 mL， 置 100 mL量瓶中， 加 70%乙醇稀釋至刻度， 搖勻， 得供試品溶液3。 取上述 3種供試品溶液， 采用紫外分光光度法， 分別在 275 nm處， 以相應(yīng)溶劑為空白， 測定吸光度， 結(jié)果吸光度分別為 0.265、 0.268、0.312。 因此方法 1、 方法 2 均能去除揮發(fā)油干擾， 且效果相當， 因此本實驗中供試品溶液制備采用方法2。

3.3 測定方法的選擇 實驗中曾考慮以利卡啉-B對照品，采用比色法測定總木脂素含有量［9］， 但肉豆蔻中含有亞甲二氧基結(jié)構(gòu)的木脂素成分較少，故采用紫外法直接測定。

［ 1 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010:212.

［2］ 王 瑩，楊秀偉.肉豆蔻中新木脂素類化合物的定量分析［J］.中國現(xiàn)代中藥， 2005， 10(2):10-13.

［3］ 張 蕾，徐云峰，沈 碩， 等.肉豆蔻的化學成分研究［J］.中國現(xiàn)代中藥， 2010， 12(6):16-19.

［ 4 ］ 李秀芳， 吳立軍， 賈天柱， 等.肉豆蔻的化學成分［J］.沈陽藥科大學學報， 2006， 23(11):698-699.

［5］ 李 飛，楊秀偉，程 燕，等.肉豆蔻木脂素的體外代謝初步研究［ J］ .中國新藥雜志， 2008， 17(7):560-564.

［6］ 王 聰，孟曉偉，劉永剛，等.肉豆蔻對照品去氫二異丁香酚制備工藝［J］.中國實驗方劑學雜志， 2012， 18(4): 74-78.

［7］ 劉輝鑫，袁 柯，程存歸.紅花芒毛苣苔總黃酮提取工藝研究［ J］ .中成藥， 2012， 34(5):956-958.

［8］ 鄭曉珂，郭永慧，王彥志，等.正交設(shè)計優(yōu)選馬尾松松針中總 木 脂 素 提 取 工 藝 ［ J］.中 藥 材， 2010， 33(3): 467-469.

［9］ 王衛(wèi)峰，金惠敏，丁 腈，等.比色法測定南五味子中總木脂素的含量［J］.西北藥學雜志， 1999， 14(5):197.

R284.2

:B

:1001-1528(2014)02-0420-02

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.049

2013-02-06

基金項目 國家自然科學基金項目 (81274084)

袁子民 (1975—) ， 男， 副教授， 博士， 研究方向: 中藥炮制工藝及質(zhì)量標準。 Tel:(0411)87586010， E-mail:yuanzmin @163.com

*通信作者: 賈天柱， 男， 教授， 研究方向: 中藥炮制工藝及質(zhì)量標準。 Tel:(0411)87586499， E-mail:jiatianzhu51@yahoo.com.cn