復葉耳蕨總黃酮對大鼠骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化的影響

梁廣勝， 殷嫦嫦， 殷 明， 鄔亞華， 李輝敏， 劉玉亮，3， 魏強強，3

（1.九江學院醫學部分析檢測實驗室， 江西 九江 332000； 2.南昌大學第二附屬醫院骨一科， 江西 南昌330006；3.南昌大學研究生院醫學部， 江西 南昌 330006）

復葉耳蕨總黃酮對大鼠骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化的影響

梁廣勝1，2，3， 殷嫦嫦1*， 殷 明2， 鄔亞華1， 李輝敏1， 劉玉亮2，3， 魏強強2，3

（1.九江學院醫學部分析檢測實驗室， 江西 九江 332000； 2.南昌大學第二附屬醫院骨一科， 江西 南昌330006；3.南昌大學研究生院醫學部， 江西 南昌 330006）

目的 研究復葉耳蕨總黃酮對大鼠骨髓間充質干細胞向成骨分化的影響。方法 采用全骨髓差速貼壁法體外分離、 純化和培養大鼠骨髓間充質干細胞； 取 P3代細胞， 分實驗組和對照組， 用流式細胞儀測定細胞表面標志物鑒定細胞， 采用 MTT法檢測細胞生長曲線。 顯微鏡下觀察兩組的細胞形態和組織化學染色的鈣化結節； 速率法測定堿性磷酸酶 （ALP） 活性和 RT-PCR檢測骨髓間充質干細胞誘導分化過程中骨橋蛋白和 I型膠原的 mRNA表達來鑒定成骨作用。 結果 體外培養的細胞表達表面標志； 復葉耳蕨總黃酮對骨髓間充質干細胞內 ALP活性增高并形成明顯鈣結節； PCR結果顯示復葉耳蕨總黃酮上調骨橋蛋白和 I型膠原的 mRNA表達。 結論 20 μg/mL復葉耳蕨總黃酮可促進大鼠骨髓間充質干細胞定向分化為成骨樣細胞。

復葉耳蕨總黃酮；骨髓間充質干細胞；增殖；堿性磷酸酶；成骨分化

江西百姓采用民間秘方復葉耳蕨治療黃疸性肝炎有長久的歷史，但有不少孕婦在用該草藥治療肝炎的過程出現流產，故引起研究者的注意，進行了系列研究。研究結果表明復葉耳蕨具有抗生育、加強子宮收縮等類激素作用，發揮藥理作用的主要成分是黃酮類化合物［1］。 進一步研究發現， 復葉耳蕨總黃酮中含有眾多類黃酮、香豆素類化合物、蒽醌類和其他化合物［2］。 有研究報道， 黃酮類化合物在脂質過氧化、 DPPH自由基清除、羥基自由基清除及 H2O2清除方面表現出劑量依賴性的抗氧化能力和調節氧化應激信號通路進而調節成骨分化及成骨細胞的功 能［3-4］。 因此推測， 復葉耳蕨 總黃酮可能具有較強的促進骨髓間充質干細胞 （BMSCs）成骨分化作用。本實驗研究復葉耳蕨總黃酮對大鼠BMSCs的增殖和成骨分化的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

1.1.1 動物 4 周齡健康清潔級 SD大鼠 5 只， 雌雄不限， 體質量約 40 g， 購自湖南斯萊克景達實驗動 物 有 限 公 司，合 格 許 可 證 號： HNA SLKJ20122049。

1.1.2 受試物 藥材于 2012 年 10 月采自江西廬山的秀峰，經九江森林植物標本館館長譚策銘鑒定為刺頭復 葉 耳 蕨 Arachniodes exilis（ Hance） Ching的根莖， 標本 （No.AEC1210）存放于九江學院基礎醫學院生化教研室實驗室。復葉耳蕨總黃酮的提取由九江學院基礎醫學院藥學系李輝敏副教授提取。 提取方法為采用超聲波輔助的 75%乙醇浸提，用旋轉蒸發將乙醇提取液濃縮，后用聚酰胺對其進行純化；再經過冷凍干燥得復葉耳蕨總黃酮的干燥品 （用蘆丁作對照品， 采用 HLPC法測得所提取的復葉耳蕨總黃酮含有蘆丁樣結構的化合物為75%）。復葉耳蕨總黃酮呈粉末狀、 黃棕色至紅棕色， 木化成品［3］。 稱取 10mg復葉耳蕨總黃酮溶于100 μL的 DMSO， 取 10 μL上 述 溶 液 混 入 于9 990 μL完全培養基中， 配制成 100 μg/mL的復葉耳蕨總黃酮貯存液，然后再配制成不同質量濃度的受試物即配制含藥的完全培養基，這些培養基用于相應實驗組的細胞學實驗。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM/F12 （ Hyclone公司，澳大利亞）、 Fetal Bovine Serum （GIBCO公司， 美國）、 堿性磷酸酶 （ALP） ［ Assay Kit Based on IFCC （ 2007 ） ］ 、 MTT粉 （ Solarbio公 司， 中 國 ）、0.25%胰蛋白酶 （含 EDTA）、 PBS 粉劑、 細胞裂解液 （北京普利萊基因技術有限公司）、 校準品及質控血清 （中生北控股份有限公司產品）。 6 孔培養板 （CORNING公司， 美國）、 TS100-F倒置相差顯微鏡 （Nikon 公司， 日本）、 超級恒溫水浴 HH-601 （常州國華電器有限公司）、L-3180 型半自動生化分析儀 （上海科華實驗系統有限公司）、 CO2恒溫水浴箱 （SIM公司）、 超凈臺 （蘇州凈化設備有限公司）、 Model680 型酶標儀 （ BIO-RAD公司，美國）、 血球計算板 （上海求精生化試劑儀器有限公司）、 超速離心機 （Sigma公司）、 二甲基亞砜（DMSO Sigma公司）、 流式細胞儀 （美國 B—D公司 Ver3.0）、 茜素紅粉 （西隴化工股份有限公司）、硝酸銀 （上海三愛思試劑有限公司）、硫代硫酸鈉（天津市風船化工試劑科技有限公司）、中性紅（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠 BMSCs體外分離、純化及培養

無菌條件下獲取大鼠雙側股骨、脛骨并去兩側骨骺端， 用 PBS 緩沖液反復沖洗骨髓腔， 收集骨髓細胞于離心管中， 1 000 r/min 梯度離心 5 min， 棄上清， 加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基充分吹打均勻，重復離心 1 次， 棄上清， 加入含 10%FBS的 DMEM/F12 培養基重懸細胞沉淀， 調整細胞密度為 1 ×106個/mL， 接種于 25 cm2的培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2相對飽和濕度的培養箱中孵育。 48 h后首次換液， 棄掉未貼壁細胞， 以后每2～3 d換液1次， 純化骨髓間充質干細胞。 細胞達80% ～90%的融合， 胰蛋白酶消化傳代。 倒置顯微鏡下觀察原代及傳代細胞的生長狀況及形態特征，流式細胞儀分析細胞表面的標志物 CD44 和 CD90鑒定骨髓間充質干細胞。

1.2.2 細胞生長曲線的測定 （MTT比色法） 取生長良好且融合達 80% ～90%的 P3代細胞， 常規消化 離心， 棄上清， 調整 細 胞 密 度 為 1 ×104個/mL， 按每孔 200 μL接種于 96 孔板， 設立 5 個實驗復孔和空白對照組， 置于37℃恒溫培養箱中孵育。 每2 d更換培養基， 分別在第 1 天 ～第 11天共11 個時間點各取 1 個 96 孔板行 MTT檢測：每孔加入 5%MTT溶液 20 μL孵育 4 h，然后吸棄上清液， 每孔加入二甲基亞砜 （DMSO） 150 μL，充分搖勻震蕩 10 min 待結晶物充分溶解后， 應用酶標儀490 nm波長檢測各孔的吸光度值 （A值），記錄結果， 并繪制成大鼠 BMSCs的生長曲線 （X軸-時間， Y軸-吸光度）。

1.2.3 復葉耳蕨總黃酮對 BMSCs增殖的影響 取P3代細胞， 以 2 000 個/mL接種于 96 孔培養板，在37 ℃、 5%相對飽和濕度的 CO2培養箱中培養。24 h后吸去原培養基， 加入含不同質量濃度的復葉耳蕨總黃酮培養基 200 μL進行培養，對照組加入等量的普通培養基培養。 分別在 12、 24、 48、72 h 向每孔加入10 μL的 CCK液體， 孵育2 h， 用酶標儀測定 450 nm處的吸光度并繪制成圖表。

1.2.4 復葉耳蕨總黃酮對 BMSCs成骨分化的影響取 P3代 BMSCs消化后按 2 ×105個/mL接種至24 孔板， 24 h 后吸去原完全培養基，按下面分組，每兩組一板進行誘導分化： 對照組為每孔加 DMSO（0.1%） +DMEM/F-12 培 養 液； 實 驗 組 為 含 20 μg/mL復葉耳蕨總黃酮 （0.1%DMSO） 的培養基。 共誘導7 d，每 3 d換液 1次。 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化并拍照，并用于以下檢測。

1.2.5 檢測 ALP酶活性 采用 IFCC推薦的磷酸對硝基苯酚法測定 （速率法），操作步驟按說明書， 記錄檢測樣品每分鐘吸光度變化值 （ΔA/ min）， 計算樣品中堿性磷酸酶活力 （ U/L）， 并繪制成表格進行比較。

1.2.6 鈣化結節染色 成骨誘導培養第 7 天采用Alizarin Red S （ ARS） 染色法和 Von Kossa染色法進行鈣化結節的組織化學染色， 并在 10 ×10 倍顯微鏡 下 觀 察。 Alizarin Red S 法：PBS 沖 洗 3 次，95%乙醇固定 10 min，三蒸水沖洗 3 次；加 2%茜素紅后， 置于 37 ℃孵育 30min； 三蒸水沖洗 3 次，干燥、封 片。 鈣 結 節 成 紅 色。Von Kossa染 色：PBS 沖洗 3 次， 95%乙醇固定 5 min， 三蒸水漂洗 3次， 加5%硝酸銀溶液， 紫外照射 1.5 h， 漂洗 3遍，加5%硫代硫酸鈉中和殘留硝酸銀， 漂洗 3遍， 1% 中性 紅 復 染 10 min， 漂 洗 3 遍， 干 燥，封片。

1.2.7 RT-PCR檢測 常規種板 （24 孔板）， 分 2組： 加藥組 （20 μg/mL復葉耳蕨總黃酮） 和對照組 （加等量完全培養基）， 每組設4 個復孔， 培養24 h 后按照康為世紀 RNA提取和逆轉錄說明書進行操作， 以逆轉后的 cDNA為模版擴增檢測骨橋蛋白 （OPN）和 I型膠原 （ Coll-Ⅰ）mRNA的表達，擴增后制膠跑電泳拍照， 目標基因 OPN、 Coll-Ⅰ、內參 GAPDH的引物見表1。

表 1 RT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence of real time RT-PCR

1.2.8 統 計 學 分 析 所 有 數據 均 采 用 SPSS 19.0軟件的 onewayANOVA方差分析統計分析， 結果以平均數 ±標準差 （）表示， 并兩兩樣本間率的比較采用 χ2檢驗， 檢驗水準 α=0.05， P＜0.05 為差異有統計學意義， P＜0.01 為具有高度統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠 BMSCs形態學特征 第 3 天首次換液可見分散的懸浮細胞，以折光性強的圓形細胞為主（ 圖1A） ； 6 ～10 d 后， 貼 壁 細 胞 明顯 增 多， 出 現成纖維樣細胞外觀，呈長梭形 （ 圖 1B和圖 1C）；14 d 左右細 胞可達 80% ～90%的融合， 細 胞 排 列具有明顯的方向性， 呈漩渦狀 （圖 1D）。 多次傳代后，細胞仍呈現梭形細胞群，呈漩渦狀平行生長（圖1E）。

2.2 大鼠 BMSCs流式細胞儀鑒定 流式細胞儀檢測結果顯示 CD44 表達陽性， CD90 陰性， BMSCs均一性好， 純度達90%以上。 鑒定結果見圖 2。

圖 1 大鼠骨髓間充質干細胞的形態觀察 （ ×100）Fig.1 Cellular m orphology observation （ ×100）

圖2 小鼠骨髓間充質干細胞的表面抗原分子表達情況Fig.2 Surface an tigens of rat bonemarrow mesenchymal stem cells

2.3 細胞增殖測定 （MTT比色法） 在酶標儀上選擇 490 nm波長檢測各孔吸光值， 以時間 （t） 為橫軸， 吸光度 （A） 為縱軸繪制 P3代細胞生長整個過程中細胞數目的動態變化 （圖 3）。 BMSCs在接種的1～3 d內增殖相對緩慢， 處于潛伏期。 在第4天～第9天生長曲線近似成線性曲線，表明這段時間內細胞成對數生長，處于指數對數生長期，第10天以后曲線相對變緩， 細胞增殖速率減慢，處于平臺期。

圖3 骨髓間充質干細胞的生長曲線Fig.3 G row th curve of rat bonemarrow mesenchymal stem cells

2.4 復葉耳蕨總黃酮對 BMSCs增殖的影響 與對照組比較， 20 μg/mL復葉耳蕨總黃酮 對大鼠的BMSCs增殖具有輕度促進作用。 隨著復葉耳蕨總黃酮質量濃度的增加，促細胞增殖活性降低，高于40 μg/m L則表現為明顯的抑制增殖作用且呈劑量依賴性地降低大鼠 BMSCs的增殖能力， 見圖4。

2.5 ALP活性檢測 各組成骨分化過程中 ALP活性檢測結果顯示： 實驗組的第 6 天 ALP活性明顯高于第 3 天 （P＜0.05）， 而3 d 和6 d 后的實驗組ALP活性明顯高于相應的對照組 （P＜0.05）。 見表2。

圖4 復葉耳蕨總黃酮對骨髓間充質干細胞生長的影響Fig.4 Effect of grow th curve of total flavonoids from Arachniodes exilis on rat bonemar row mesenchymal stem cells

表2 堿性磷酸酶活性測定 （， n=5）Tab.2 Determ ination of alkaline phosphatase activity

表2 堿性磷酸酶活性測定 （， n=5）Tab.2 Determ ination of alkaline phosphatase activity

注： 與對照組相比，**P＜0.01

（， n=5）組 別 吸光度 （A）3 d 6 d對 照組0.115 0 ±0.002 2 0.228 6 ±0.004 9實 驗組 0.304 4 ±0.002 3** 0.434 4 ±0.004 0**

2.6 鈣結節染色 ARS 染色： 復葉耳蕨總黃酮誘導組細胞胞漿中可見橘紅色礦化結節形成，茜素紅染色陽性，而對照組則為陰性。細胞聚集的地方鈣結節明顯增多。 Von Kossa染色 ： 復葉耳蕨總黃酮誘導組加入硝酸銀后， 在紫外線下染色 90 min 后可見黑色顆粒，光鏡下可見粗大的黑色結節，且周圍有粉紅色細胞結構。 見圖5。

2.7 RT-PCR檢測結果 大鼠經誘導 6 d 后結果：

圖5 兩種染色法鑒定鈣結節Fig.5 Identification of two kinds of calcium nodules staining

與對照組相比， 實驗組的 OPN和 Coll-Ⅰ轉錄水平明顯增強 （P＜0.05 或 P＜0.01）。 說明復葉耳蕨總黃酮可以促進 BMSCs高表達 OPN和 Coll-Ⅰ， 利于成骨分化進程。 見圖6。

圖6 PCR電泳圖和 PCR灰度掃描定量結果Fig.6 PCR electrophoresis and quantitative results of PCR grayscale scanning

3 討論

BMSCs具有眾多優點而被認為是臨床上較理想的治療性細胞，如提取簡單方便、來源充足、攜帶免疫調節機制和抗炎機制、避免免疫排斥反應、高度自我 更 新 能 力 和 多 向 分 化 潛 能 等［5-6］。 特 定 的作用因素促進 BMSCs分化為成骨細胞，有助于促進骨折愈合和骨質疏松癥的防治［7］， 因此尋找促進 BMSCs分化為成骨細胞的物質對于干細胞治療在臨床的應用具有重要的意義。 獲得純化 BMSCs是干細胞治療關鍵步驟，本實驗采用全骨髓貼壁法分離、 純化 BMSCs， 通過細胞形態及流式細胞儀鑒定細胞表面標記物分析所得的 BMSCs為高度純化的細胞， 細胞增殖實驗證明 BMSCs生長良好，這些結果為下一步實驗奠定基礎。

黃酮類化合物對細胞作用具有雙向性，即在不同的劑量下可呈現促增殖或抑制增殖作用，因此選擇一個適合實驗目的藥物劑量是誘導 BMSCs分化成骨細胞實驗關鍵環節，通過細胞增殖生長實驗，發現低質量濃度復葉耳蕨總黃酮促進 BMSCs的增殖，高質量濃度復葉耳蕨總黃酮具有抑制其增殖。與對照組相比， 20 μg/mL復葉耳蕨總黃酮組的 A值在不同時間均略高于對照組，說明復葉耳蕨總黃酮能輕度促進細胞增殖，然而復葉耳蕨總黃酮質量濃度高于 40 μg/mL時， 能明顯抑制 BMSCs的增殖，且隨復葉耳蕨總黃酮的質量濃度增高，其抑制作用越強。 增殖與分化是 BMSCs的兩個重要的生物學特性，兩者之間存在相互關聯的關系，過度增殖勢必抑制分化，但抑制細胞的增殖亦影響細胞生物學活性， 因此， 本實驗選擇對 BMSCs有輕度促進增殖作用的質量濃度 （20 μg/mL） 復葉耳蕨總黃酮作為實驗劑量即為實驗組。

目前，ALP活性、 OPN和 Coll-Ⅰ的表達及礦化結節的檢測是鑒定 BMSCs成功分化為成骨細胞的主要標志［8-9］。 ALP可分解有機 質中磷 酸， 增加局部無機磷酸鹽濃度，促進礦化，是成骨細胞分化和功能成熟的前期標志［10］，其活性越高， 說明前期成骨細胞向成熟成骨細胞的分化越明顯。本實驗用 20 μg/m L復葉耳蕨總黃酮干預后的第 3 天和第6 天， ALP活性明顯增大，另外， 實驗組的 ALP活性均比對照組高，且在第3天時兩組的差異性更顯著 （P＜0.01）， 實驗組的 ALP活性比對照組高 2倍以上， 這說明復葉耳蕨總黃酮能明顯促進 BMSCs生成 ALP或增強 ALP的活性。 OPN和 Coll-Ⅰ是分化成熟成骨細胞分泌的特異性蛋白，可作為成骨細 胞 分 化 的 中 期 指 標［11-12］。 RT-PCR 實 驗 還 發現， 在誘導的第 6 天， 實驗組的 OPN和 Coll-Ⅰ的mRNA比對照組的表達量明顯增加。 另外， 礦化結節的形成是成骨細胞分化成熟的重要標志。實驗中， 在誘導的第 7 天， 采用了 Alizarin Red S 染色和 Von Kossa染色兩種染色方法分別對兩組進行礦化結節染色定性鑒定，兩種染色方法顯示實驗組礦化結節染色陽性，表明實驗組培養的細胞具有成骨功能，并且復葉耳蕨總黃酮組的礦化結節陽性率明顯高于對照組。以上結果表明：復葉耳蕨總黃酮對BMSCs向成骨細胞分化具有明顯的促進作用。

本實驗通過研究和探討復葉耳蕨總黃酮對大鼠BMSCs向成骨分化的影響發現， 復葉耳蕨總黃酮可明顯促進 BMSCs向成骨分化作用； 其作用是通過增強細胞內 ALP活性、促進鈣結節形成、 上調骨橋蛋白和Ⅰ型膠原的表達，進而促進成骨分化進程。本研究為后續進一步研究復葉耳蕨總黃酮促成骨的機制奠定一定的基礎。

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Effect of total flavonoids from Arachniodes exilis on proliferation and osteogenic differentiation of rat bonemarrow mesenchymal stem cells

LIANG Guang-sheng1，2，3， YIN Chang-chang1*， YIN Ming2， WU Ya-hua1， LIHui-min1，LIU Yu-liang2，3， WEIQiang-qiang2，3
（1.Analysis and Test Laboratory of Jiujiang University， Jiujiang 332000， China； 2.First Department of Orthopedics， The Second Hospital Affiliated to Nanchang University， Nanchang 330006， China； 3.Graduate School of Medicine Nanchang University， Nanchang 330006， China）

AIM To study the effect of total flavonoids from Arachniodes exilis on proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells（ BMSCs） .METHODS Rat BMSCs， isolated from rats bonemarrow in vitro by whole bonemarrow adherentmethod，was purified and cultured.Identification of thesurface marker of BMSCs and determination of their growth curve were completed by MTT.They were divided into experimental（ total flavonoids from Arachniodes exilis） and control groups， and osteogenesis was identified bymicroscopic cellmorphology， the activity of alkaline phosphatase， the formation of calcified nodules by staining， and the expression ofosteopontin and collagen 1 were tested by RT-PCR.RESULTS Cells cultured in vitro expressed the surfacemarkers of BMSCs.The total flavonoids from Arachniodes exilis improved the activity of ALP， promoted the formation of calcium nodule， and increased the expression of osteopontin and Icollagen shown by PCR results. CONCLUSION 20 μg/mL total flavonoids from Arachnidesexilis can promote ratbonemarrowmesenchymal stem cells to differentiate into bone cells.

total flavonoids from Arachniodes exilis； bone marrow mesenchymal stem cells； proliferation；ALP； osteogenesis

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）03-0456-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.004

2013-06-11

采用常規實驗室可用的藥理研究模型系統研究復葉耳厥抑制 HIV-1 復制的有效成分 （81160536）

梁 廣 勝 （ 1986—） ， 男， 碩 士 生， 醫 師， 研 究 方 向： 脊 柱 和 骨 關 節 疾 病， 骨 科 疾 病。 Tel： 13698416062， E-mail： lgs-19860322@163.com

*通信作者： 殷 嫦 嫦， 女， 博 士， 碩 士 生 導 師， 教 授， 研 究 方 向： 生 物 化 學 與 臨 床 生 物 化 學。 Tel： 13607920508， E-mail： yinchangchang112@163.com