鹽酸小檗堿、吳茱萸揮發油、大黃總蒽醌促進苦參堿透皮吸收的量效關系研究

李 蕓， 閆治攀， 魏舒暢， 劉永琦

（1.甘肅中醫學院， 甘肅省高校中藏藥化學與質量研究省級重點實驗室， 甘肅 蘭州 730000）

鹽酸小檗堿、吳茱萸揮發油、大黃總蒽醌促進苦參堿透皮吸收的量效關系研究

李 蕓， 閆治攀， 魏舒暢， 劉永琦*

（1.甘肅中醫學院， 甘肅省高校中藏藥化學與質量研究省級重點實驗室， 甘肅 蘭州 730000）

目的 研究不同質量分數的鹽酸小檗堿、吳茱萸揮發油、大黃總蒽醌對苦參堿透皮吸收的影響。方法 采用YB-P6 型智能透皮試驗儀， 以小鼠皮膚為滲透屏障進行體外透皮吸收試驗， 采用 HPLC法測定苦參堿的量， 計算累積透過量和透皮速率等滲透動力學參數。 結果 不同質量分數 （5%、 3%、 1%） 的 3 種物質對苦參堿透皮吸收的影響為吳茱萸揮發油 3% ＞1% ＞5% ＞空白， 大黃總蒽醌 5% ＞空白 ＞3% ＞1%， 鹽酸小檗堿 空白 ＞1% ＞3% ＞5%。 結論 吳茱萸揮發油對苦參堿有顯著的促透作用，大黃總蒽醌不明顯，鹽酸小檗堿不僅無促透作用，反而抑制其透皮吸收。

苦參堿；透皮吸收；鹽酸小檗堿；吳茱萸揮發油；大黃總蒽醌；量效關系

透皮吸收制劑具有可維持穩定的血藥濃度、避免肝臟 “首過效應”、 降低藥物毒副作用、 給藥方便等優點［1］， 是目前最 受 親 睞的一類新 型 制 劑，每年以 17%的增長率高速發展［2］。 但由于皮膚的屏障作用，使得許多藥物的透皮吸收效果往往不甚理想。促進藥物透皮吸收，是該類制劑應解決的關鍵技術。使用透皮吸收促進劑是增加藥物透皮吸收的首選方法。由于化學促滲劑氮酮、丙二醇等專屬性不強、刺激性較大等諸多缺點，從中藥中尋找促滲作用良好、 刺激性小的萜類、 植物精油等［3］天然促透劑已日益受到重視。本實驗以苦參堿作為被促滲工具藥，從傳統中藥制劑中使用頻率較高的“ 藥引類” 中藥 吳茱萸［4-8］、 黃 連［6，9］、 大黃［9-10］中提取吳茱萸揮發油、鹽酸小檗堿和大黃總蒽醌作為促滲劑，考察這3種天然提取物對標示物苦參堿的透皮促進作用，以發現有促透活性的天然透皮促進劑。

1 實驗材料

1.1 儀器 Aglient-1100 高效液相色 譜 儀； DAD檢測器；YB-P6 型智能透皮試驗儀 （天津天光光學儀器有限公司）； SY3200-T超聲清洗機 （上海聲源超聲波儀器有限公司）； BT125D電子天平 （賽多利斯科學儀器有限公司）；雙蒸水機 （Classic series-HeadForce-0902008 力康發展有限公司）。

1.2 試藥 吳茱萸飲片 （批號 20080201）、 黃連飲 片 （ 批 號 20080209 ）、 大 黃 飲 片 （ 批 號20080209） 經甘肅中醫學院魏舒暢教授鑒定分別為蕓 香 科 植 物 吳 茱 萸 Evodia rutaecarpa （ Juss.）Benth 干 燥 近 成 熟 果 實、 毛 茛 科 植 物 黃 連 Coptis chinensis Franch. 的 根 莖、 蓼 科 植 物 掌 葉 大 黃Rheum palmatam L的 干 燥 根 莖。苦 參 堿 對 照 品（中國藥品生物制品檢定所， 批號 110805-200508，供含量測定用）； 苦參堿 （純度 ＞98%， 四川成都恩科華生物技術有限公司， 批號 SKH20110768）；吳茱萸揮發油、 鹽酸小檗堿 （93.45%）、 大黃總蒽醌 （純度 94.6%） 均為自制。詩碧脫毛膏 （上海詩碧化妝品有限公司， 批號 50260002）； 甲醇為色譜純；三乙胺為分析純；水為雙蒸水；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 SPF級昆明種小鼠， 體質量（20 ±2） g， 雄性， 購于 （甘肅中醫學院實驗動物中心）， 實 驗動物 生 產許可證號： SCXK （ 甘）2011-0001， 實 驗 設 施 合 格 證： SYXK （ 甘 ）2011-0001。

2 天然透皮促進劑的制備

2.1 鹽酸小檗堿的制備 實驗方法采用 70%乙醇提取， 將所得干膏用 0.5%硫酸處理，酸水液加石灰乳 （調 pH 10 ～12）處理， 濾液再用濃 HCl調 pH 1 ～2 處理， 氯化鈉鹽析， 放置， 所得沉淀反復用熱水溶解 HCl調 pH 2 ～3 處理， 得粗總生物堿，用紫外-可見分光光度法測定最高含有量 93.45%。

2.2 吳茱萸揮發油的制備 取吳茱萸藥材 1.5 kg，平均分成 3 份， 每份 500 g， 每份加 6 倍量蒸餾水加熱回流提取 5 h， 得揮發油 5.7 m L。

2.3 大黃總蒽醌的制備 將大黃飲片以 75%乙醇為溶劑回流提取，濃縮干燥得干膏。取干膏適量，以 8%HCl溶液和三氯甲烷回流提取得到粗大黃總蒽醌。 用 D301 大孔樹脂純化， 以 75%乙醇洗脫，得到大黃總蒽醌，UV法測定含有量以大黃素計為 94.6%。

3 苦參堿體外透皮試驗

3.1 分析方法的建立

3.1.1 色譜條件 色譜柱為 Hibar? 250-46，Purospher? STAR，RP-18e（5 μm） sorbent Lot；流動相為甲醇-0.05%三乙胺溶液 （70 ∶30）； 體積流量 1 mL/min； 檢測波長 220 nm； 柱溫 25 ℃； 進樣量 20 μL； 理論塔板數按苦參堿計算不低于 2 000。3.1.2 溶液的制備

3.1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取苦參堿對照品 4.35 mg， 置 10 mL量瓶中， 用 70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.1.2.2 供試品溶液的制備 將取出的透皮接受液 （因有效透皮面積較小， 故同一樣品平行3份，合并） 水浴蒸干， 殘渣用甲醇溶解并定容至 2 mL，即得。

3.1.2.3 苦參堿過飽和溶液的制備 稱取苦參堿對照品 250.60 mg， 置 50 mL量瓶中， 加入雙蒸水，溶解，搖勻，得不溶性混懸液。

3.1.2.4 陰性溶液的制備 取分別含有吳茱萸揮發油、鹽酸小檗堿、大黃總蒽醌的水溶液，進行透皮試驗12 h， 將透皮接受液蒸干， 殘渣用甲醇溶解并定容至2 m L， 即得。

3.1.3 系統適應性試驗 取上述對照品溶液、 供試品溶液及陰性對照品溶液，在上述色譜條件下，12 h的陰性樣品無干擾。 理論塔板數按苦參堿計算不低于 5 000。 見圖 1。

3.1.4 線性關系考察 取苦參堿對照品溶液（0.174 mg/mL），分別進樣 1、 5、10、 15、 20、25 μL， 記錄峰面積， 以峰面積 （Y） 對進樣質量（μg） 進行線性回歸， 回歸方程為 Y=1 262.4X+ 11.916，r=1.0， 結果 表明： 苦參堿在 0.174 ～4.35 μg內呈良好線性關系。

圖1 苦參堿陰性對照、 對照品及透皮樣品的 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram s of negative sam p le， reference substances and transdermal sam p les

3.1.5 精密度試驗 取同一對照品溶液重復進樣5 次， 得峰面積 RSD為0.94%

3.1.6 穩定性試驗 取供試品溶液， 在 0、1、2、3 d 分別進樣 20 μL， 測定峰面積并計算苦參堿的RSD為 1.67%， 說明供試品溶液在 3 d 內穩定。

3.1.7 重復性試驗 取同一批樣品 5 份， 按供試品溶液的制備方法制備溶液， 按 “3.1.1” 項下色譜條件測定，得苦參堿的 RSD為1.02%。

3.1.8 最低檢測限 精密吸取對照品溶液適量，加 70%甲醇逐步稀釋至色譜圖中苦參堿峰高為噪音的3 倍 （信噪比 S/N≥3）。 苦參堿的最低檢測限為 0.01 μg/mL。

3.1.9 回收率試驗 取對照品溶液適量， 按“3.2.3” 項下方法所得的 12 h 的陰性溶液稀釋成含苦參堿 0.017 4、0.174、 4.35 mg/mL的低、中、高 3 個質量濃度的對照品溶液各 3 份， 進樣 20 μL測定， 回收率分別為 98.6%、 102.7%、101.4%，RSD分別為 1.68%、 1.37%、1.13%。

3.2 苦參堿的體外經皮滲透度試驗

3.2.1 離體小鼠皮膚制備 取體質量在 18 ～22 g范圍內的雄性昆明種小鼠， 實驗前 24 h時用脫毛膏脫去腹部絨毛，禁食不禁水。實驗時，將小鼠頸椎脫臼處死，剝離腹部皮膚，剔除皮下脂肪組織及粘連物，用生理鹽水反復沖洗干凈后用生理鹽水浸泡， 置4 ℃冰箱保存， 24 h內使用。 使用前仔細檢查鼠皮的完整性。

3.2.2 供給液和接受液的制備 供給液由苦參堿過飽和溶液和質量分數為 5% ～1%的透皮促進劑組成。以不加透皮促進劑的苦參堿飽和溶液作為對照。 10 組供給液分別為： A為不含促進劑 （作對照）， B～D為 5% ～1%鹽酸小檗堿，E～G為5% ～1%吳茱萸揮發油， H～J為 5% ～1%大黃總蒽醌。接受液為生理鹽水。

3.2.3 經皮滲透試驗 采用 YB-P6 型智能透皮試驗儀， 有效擴散面積為 2.355 （0.785 ×3） cm2，接受室容積為 15 mL。 取小鼠皮膚，用生理鹽水沖洗干凈，剪成適宜大小，置于透皮擴散池的供給室與接受室之間，固定。角質層面向供給室。將接受室內注入生理鹽水作為接受液，并排除氣泡，使皮膚里層與接受液完全接觸。將安裝好的擴散池置于（32 ±0.1） ℃恒溫水浴 中， 200 r/min 磁 力攪拌。供給室加入含 （或不含） 透皮促進劑的苦參堿過飽和溶液后封閉，分別于試驗開始后 2.0、 4.0、6.0、8.0、 10.0、 12.0 h 時取出全部接受液， 同時補加同體積 （32 ±0.1） ℃預熱的生理鹽水。 將取出接受液水浴蒸干， 用甲醇定容至 2 m L， 并用HPLC測定。

3.2.4 結果處理 樣品按照 “3.1.1” 項下色譜條件進行測定，按下式計算累積滲透量Q n （μg/cm2）。

Cn為第 n 個取樣點測得的藥物質量濃度， Ci為第 i個取樣點測得的藥物質量濃度。

以單位面積累積滲透量 （Q）為縱坐標， 時間（t） 為橫坐標作圖， 得藥物累積滲透曲線， 對所得曲線進行回歸，求出斜率，即為藥物的滲透速率J（μg/cm2· h）。 直 線 與 t軸的 交 點 為 滯 后 時 間（ Tlag） 。增滲倍數 （ ER） 為加入滲透促進劑后與未加入滲透促進劑時藥物在 12h 內的透皮速率常數之比。結果見表1。

表 1 不同物質對苦參堿的滲透動力學參數 （n=5，）Tab.1 K inetics parameters of matrine w ith various substances（ n=5，）

表 1 不同物質對苦參堿的滲透動力學參數 （n=5，）Tab.1 K inetics parameters of matrine w ith various substances（ n=5，）

促進 劑 Q/（ μg·cm-2） Q-t方程 r J/（ μg·cm-2·h-1） ER Tlag0.64 5.0%鹽酸小 檗堿 62.31 ±3.42 Q=5.711 3t-11.311 0.982 8 5.7113 ±1.09 0.28 1.98 3.0%鹽酸小檗堿 157.57 ±7.89 Q=13.482t-13.050 0.992 9 13.482 ±2.09 0.67 0.97 1.0%鹽酸小 檗堿 207.65 ±8.90 Q=15.613t-4.748 0 0.953 7 15.613 ±1.78 0.78 0.30 5.0%吳茱萸揮發油 369.38 ±21.90 Q=31.230t-25.496 0.992 5 31.23 ±2.98 1.55 0.82 3.0%吳茱萸 揮發 油 1 319.65 ±31.8 Q=136.50t-257.79 0.994 2 136.5 ±4.89 6.79 1.89 1.0%吳茱萸揮發油 568.44 ±9.06 Q=51.195t-50.329 0.998 5 51.195 ±3.86 2.55 0.98 5.0%大黃總蒽醌 259.12 ±4.90 Q=18.122t-43.411 0.990 1 18.122 ±0.93 0.90 2.40 3.0%大黃總 蒽醌 199.82 ±15.89 Q=16.406t-7.516 7 0.992 8 16.406 ±0.98 0.82 0.46 1.0%大黃總蒽醌 200.67 ±12.90 Q=16.025t空白組 225.11 ±5.56 Q=20.099t-12.892 0.998 4 20.099 ±1.89 —-6.776 7 0.985 2 16.025 ±0.85 0.80 0.42

以取樣時間 （t） 為橫坐標， 累積滲透量 （Q）為縱坐標， 繪制取樣時間-累積滲透量 （Q） 曲線，見圖2。

圖2 不同物質對苦參堿的透皮促進作用的影響Fig.2 Effect of various substances on penetration enhancement of matrine

結果顯示，不同質量分數 （5%、 3%、 1%）的3種物質對苦參堿透皮吸收的影響均具有一定的量效關系，總的趨勢，吳茱萸揮發油為 3% ＞1%＞5% ＞空白， 大黃總蒽醌為 5% ＞空白 ＞3% ＞1%， 鹽酸小檗堿為空白 ＞1% ＞3% ＞5%。

吳茱萸揮發油對苦參堿有顯著的促透作用，并與質量分數呈正相關， 以3%促透作用最好。 大黃總蒽醌對苦參堿促透作用不明顯。鹽酸小檗堿的促透作用與質量分數呈負相關，說明其不但沒有促透作用，反而抑制苦參堿的透皮吸收。

4 討論

4.1 促 滲 工 具 藥 的 選 擇 苦 參 堿 （ matrine，Mat）， 化學名 Matddin-15-one， 屬于四環喹嗪啶類化合物，分子骨架可看作2個喹嗪啶環的稠合體［11］； 相對分子質量 248.38； 苦參堿最常見的是α-型結晶， 其熔點為 76 ℃； 苦參堿口服后具有吸收快、消除慢和一定程度的首過效應，在家兔體內消除半衰期為 4.6 h［12］。生物利用度低于 44.0%，大鼠口服后絕對生物利用度只有 17.1%左右［13］，在水中的溶解度大于1mg/mL， 在 pH為5 ～9 條件下， 表觀油水分配系數在 0.052 ～4.216 之間［14］。苦參堿的理化性質表明它可作為相對分子質量 600道爾頓以下、 熔點200 ℃以下、 油水分配系數適中的較易透過皮膚屏障類藥物的代表。

4.2 透皮促進效果比較 本實驗考察了質量分數為 5%、 3%、1%的吳茱萸揮發油、 鹽酸小檗堿及大黃總蒽醌對苦參堿的透皮促進作用。結果表明，吳茱萸揮發油對苦參堿有顯著的促透作用，并具有濃度依賴性， 在 1% ～3%范圍內量效關系顯著，以 3%促透作用最好， 5%時促透作用下降， 并顯著延長透皮時滯；大黃總蒽醌的促透作用不明顯；鹽酸小檗堿不但沒有促透作用，反而抑制苦參堿的透皮吸收，并隨濃度的增大，透皮時滯也隨之延長，可能是因為促滲物和被促滲物均為生物堿，存在競爭性抑制現象。實驗提示：被考察的3種提取物中，唯吳茱萸揮發油具有促透活性，可進一步研究其透皮促進機理，這將在后續工作中進行。

4.3 透皮屏障的選擇、 處理與保存 實驗篩選了大鼠、小鼠腹部相同部位皮膚的滲透效果，結果大鼠皮膚的透皮時滯較長，均在6 h以上，因此本實驗選用小鼠腹部皮膚，并且是完全相同的部位，以減少實驗誤差。另外鼠皮是否新鮮、鼠皮處理是否符合要求，都直接影響實驗結果。本實驗采用剝皮的前一天脫毛，實驗前1 d下午甚至晚上剝皮，除盡脂肪組織和粘連物后浸泡于生理鹽水中，置4℃冰箱冷藏，于次日清晨五、六點鐘取用，能保證皮膚的新鮮和滲透性能。

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Quantitative dose-effect relationship study of berberine hydrochloride，volatile oil from Euodiae Fructus and total anthraquinone in Rhei Radix et Rhizoma on percutaneous absorption ofmatrine in vitro

LIYun， YAN Zhi-pan， WEIShu-chang， LIU Yong-qi*
（Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional ChineseMedicines of the CollegeofGansu Province， Gansu Collegeof Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

matrine； transdermal absorption； berberine hydrochloride； volatile oil from Euodiae Fructus； total anthraquinone in Rhei Radix et Rhizoma； dose-effect relationship

R944

： A

： 1001-1528（2014）03-0510-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.014

2013-06-17

2009 年蘭州市科技局項目 （2009-2-11）

李 蕓 （1973—） ， 女， 碩士， 副教授， 碩士 生導師， 研 究方向： 中藥加工 炮制與制劑 工藝。 Tel： 13893362959， E-mail：liyunherb@163.com

*通信作者： 劉永琦 （1973—） ， 男， 碩士， 教授， 碩士生導師， 研究方向： 中藥免疫學與干細胞生物學。 Tel： 13919019578， E-mail：liuyongqi73@163.com