丹參注射液提取工藝研究

黃和清， 鄭斯驥， 趙鳳生

（1.上海交通大學藥學院， 上海 200240； 2.上海中西制藥有限公司， 上海 201806）

丹參注射液提取工藝研究

黃和清1，2， 鄭斯驥2， 趙鳳生1*

（1.上海交通大學藥學院， 上海 200240； 2.上海中西制藥有限公司， 上海 201806）

目的 研究并優化丹參注射液的提取工藝。 方法 以丹參有效成分含量和總固體含量為考察指標， 用 HPLC測定藥液中有效成分含量， 采用單因素實驗， 考察丹參醇沉調堿和水沉調酸過程中藥液溫度和 pH對有效成分和總固體含量的影響。 結果 醇沉調堿時隨著溫度和pH的升高， 藥液有效成分的損耗率遠大于總固體的除去率； 水沉調酸時溫度影響不大， pH降低對有效成分含量影響不大， 但總固體量呈減少趨勢。 結論 提取丹參注射液的優化工藝為：醇沉調堿過程控制藥液溫度 25 ～30 ℃， pH 8.0 ～8.5； 水沉調酸過程控制藥液溫度 20 ～30 ℃， pH 2.0 ～2.2。 按照優化后的工藝在生產規模制備的丹參注射液質量符合標準要求。

丹參注射液；提取；醇沉；水沉

丹參為唇 形 科 鼠尾草屬植 物 Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、 活血通經、清心除煩的功效，用于治療心、腦血管疾病［1-4］。 丹參的有效成分主要分 為兩大 類： 水溶性成分 （如丹酚酸類） 和脂溶性成分 （如丹參酮類）［5-8］。丹參注射 液 是 臨 床 常 用 的 中 藥 針 劑， 利用丹參中水溶性的丹酚酸類有效成分發揮藥效作用。丹參注射液的提取已有許多研究。大多數采用水提醇沉 法［9-11］， 水提醇沉 法 已 用 于 工 業 化 生 產。也有其他提取方法的研究， 如大孔 樹脂吸 附［12-13］、膜分離［14］， 這些方法還僅限于實驗室研究， 尚未應用于工業生產。

目前的丹參注射液標準制備工藝［15］， 是丹參用水提取，經過一次醇沉 （藥液含醇量 75%）、二次醇沉 （藥液含醇量 85%， pH 8 ～9）， 加注射用水沉淀， 調節 pH至 2 ～3 沉淀， 再經調節 pH、 活性炭脫色、灌封、滅菌等步驟。其中一次醇沉、二次醇沉的目的是除去藥液中的淀粉、多糖、蛋白質、樹脂、鞣質等水溶性雜質，加注射用水進行水沉和調節藥液 pH至2 ～3 的目的是除去藥液中丹參酮等脂溶性雜質。但是在除去雜質的同時，藥液中的有效成分也隨之損失。

丹參注射液質量標準［15］中規定總固體質量濃度為 10 ～30 mg/mL。總固體既包含藥液中的丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B等水溶性有效成分，又包含藥液中的樹脂、鞣質等雜質。要提高產品質量，就要降低丹參注射液的總固體量，又要使有效成分的收率不致降低過多。

丹參中水溶性有效成分丹酚酸B的收率受溫度和 pH影響很大， 而丹參注射液標準制備工藝［15］中規定的醇沉和水沉時控制的 pH范圍較寬，而且沒有明確規定醇沉和水沉時的溫度。在實際生產時產品質量不穩定，因此需要在標準制備工藝范圍內對丹參注射液的生產工藝進行優化。本實驗以丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B的收率與總固體的除去率為指標，考察醇沉調堿、水沉調酸時的溫度和pH的影響， 找出最佳的參數控制范圍以指導生產。

1 實驗儀器、 材料與方法

1.1 儀器與材料 Agilent 1100 高效液相色譜儀（ 德 國 Agilent公 司）； METTLER SevenGo pH-SG2便攜式數顯 pH計 （梅特勒-托利多公司）； METTLER AE-240 電子 天 平 （ 梅 特 勒-托 利 多 公 司）；HWS28 型電熱恒溫水浴鍋 （上海一恒科學儀器有限公司） ； GZX-GFC-101-2-BS 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博泰實驗設備有限公司）。

丹參飲片，購自山東日照丹參藥材基地，經鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參 （ Salvia miltiorrhiza Bunge） 的 干 燥 根； 丹 參 素 鈉 對 照 品 （ 批 號110855-201210）、 原兒茶醛對照品 （批號 110810-201007）、 丹 酚 酸 B 對 照 品 （ 批 號 111562-201111），購自中國食品藥品檢定研究院； 乙腈（分析純）、 三氟乙酸 （分析純）、 甲醇 （分析純）均購自 Merk KGaA公司； 95%乙醇 （藥用級）， 購自江蘇太倉新太有限公司。

1.2 丹參2 次醇沉的溫度和 pH條件優化 本實驗所用的丹參提取樣品為上海中西制藥有限公司中藥提取車間的生產中間品，提取按照丹參注射液質量標準中的制備工藝進行［15］。 取丹參 200 kg， 加水煎煮3 次， 第 1 次 2 h， 第 2、3 次各 1.5 h。合并煎液，過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.15 ～1.28 （60 ℃測定） 的清膏。 加乙醇使含醇量為75%， 冷藏 48 h， 過濾。 濾液減壓濃縮至相對密度為 1.16 ～1.26 （60 ℃測定） 的清膏， 加乙醇使含醇量為 85%， 靜置， 取上清液， 為丹參 2次醇沉液。

取丹參 2 次醇沉液若干份， 每份 500 mL， 分別置于指定溫度的恒溫水浴鍋中。待藥液溫度恒定后，在攪拌條件下向藥液中加入氫氧化鈉溶液，調節至指定 pH。 冷藏 48 h， 過濾。 濾液取樣測定丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B的量和總固體的量。每種實驗條件做3次平行實驗。

1.3 丹參水沉的溫度和 pH條件優化 上述丹參 2次醇沉液用氫氧化鈉溶液調節 pH至 8 ～9， 冷藏48 h， 過濾。濾液必要時回調 pH至中性， 減壓濃縮回收乙醇至無醇味。加注射用水成相對密度為1.01 ～1.05 （60 ℃測定） 的清膏， 冷藏 16 h， 濾過。 濾液濃縮至相對密度為 1.02 ～1.06 （60 ℃測定）的清膏，為丹參水沉液。

取丹參水沉液若干份， 每份 500 mL， 分別置于指定溫度的恒溫水浴鍋中。待藥液溫度恒定后，在攪拌條件下向藥液中加入鹽酸溶液，調節至指定pH。 冷藏， 過濾。濾液取樣測定丹參素鈉、 原兒茶醛、丹酚酸B的量和總固體的量。每種實驗條件做3次平行實驗。

1.4 車間生產規模丹參提取優化工藝的驗證 按照優化的丹參2次醇沉和水沉的工藝條件，在車間生產規模進行提取驗證。實驗進行3批。

每一批驗證實驗取丹參 600 kg， 加水煎煮 3次。 第1 次加水6 000 L， 93 ～96 ℃保溫2 h， 藥液體積 4 860 ～4 930 L。 第 2 次加水 4 200 L， 93 ～96 ℃保溫 1.5 h， 藥液體積 3 840 ～3 930 L。 第 3次加水3 000 L， 93 ～96 ℃保溫 1.5 h， 藥液體積2 630 ～2 720 L。 合并 3 次煎液， 體積 11 400 ～11 510 L， 過濾。 濾液 減 壓 濃縮至相對密 度 為1.15 ～1.28 （60 ℃測定） 的清膏， 加入乙醇進行1 次 醇 沉， 含 醇 量 為 （75 ±2）%， 藥 液 體 積1 380 ～1 412 L， 1 ～6 ℃冷藏48 h。 過濾， 濾液濃縮至相對密度為 1.16 ～1.26 （60 ℃測定） 的清膏， 加入乙醇進行 2 次醇沉， 含醇量為 （85 ± 2）%， 藥液體積 1 252 ～1 276 L。 靜置， 取上清液， 藥液溫度控制在 25 ～30 ℃， 用氫氧化鈉溶液調節 pH至 8.0 ～8.5， 1 ～6 ℃冷藏 48 h。 過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇至無醇味，加注射用水成相對密度為 1.01 ～1.05 （60 ℃測定） 的清膏， 進行水沉， 藥液體積 337 ～352 L， 1 ～6 ℃冷藏 16 h。過濾， 濾液濃縮至相對密度為 1.02 ～1.06 （60 ℃測定） 的清膏， 濾液溫度控制在 20 ～30 ℃， 用鹽酸溶液調節 pH至 2.0 ～2.2， 3 ～7 ℃冷藏 24 h。過濾， 濾液用氫氧化鈉溶液調節 pH至 6.8 ～7.0，加適量 注射用 水， 藥 液體積 122 ～136 L，煮沸0.5 h。 冷至 80 ℃，加入藥液體積 1% （W/V） 的活性炭， 攪拌，過濾。 濾液放冷后在3～7℃冷藏。過濾， 加注射用水至 400 L， 調節 pH至 6.5 ～7.2，灌封， 在 105 ℃滅菌 30 min， 即得成品。

1.5 有效成分的定量測定［15］丹參素鈉、 原兒茶醛、 丹酚酸 B的測定采用高效液相色譜法。 Kromasil 100-5 C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）。流動相 A為乙腈， 流動相 B為 0.05%三氟乙酸水溶液， 梯度洗脫 （0 ～65 min， 2%→30%A； 65 ～66 min， 30%→2%A； 66 ～80 min， 2%A）。 體積流量 0.8 mL/min。 檢測波長 288 nm。 柱溫 40 ℃。進樣量10 μL。理論板數按丹酚酸 B峰計算應不低于 200 000。

精密稱取丹參素鈉對照品、原兒茶醛對照品和丹酚酸 B對照品適量， 加 10% 甲醇溶液 （ 含0.2%冰乙酸） 配制成含丹參素鈉 200 μg/mL、 原兒茶醛 50 μg/m L和丹酚酸 B 50 μg/m L的混合溶液，即得對照品溶液。

精密吸取丹參2次醇沉或水沉的條件實驗樣品5 m L， 置 25 mL的量瓶中， 加 10%甲醇溶液 （含0.2%冰乙酸） 稀釋至刻度， 搖勻， 即得供試品溶液。

樣品測定采用外標法。

有效成分收率按下式計算：

有效成分收率 /%=

1.6 總固體量的測定［15］精密吸取丹參二次醇沉或水沉的條件實驗樣品 10 mL， 置已干燥至恒定質量的蒸發皿中， 在水浴上蒸干， 于105 ℃干燥箱中干燥 3 h， 移置干燥器中冷卻 30 min， 迅速稱定質量。

總固體除去率按下式計算：

1.7 丹參注射液成品中蛋白質、 鞣質、 樹脂的測定［15］

1.7.1 蛋白質 取丹參注射液成品 1 mL， 加新配制的 30% 磺基水楊酸溶 液 1 mL， 搖勻， 放置5 min， 不得出現渾濁。

1.7.2 鞣質 取丹參注射液成品 1 mL， 加新配制的含 1%雞蛋清的生理鹽水 5mL， 放置 10 min， 不得出現渾濁或沉淀。

1.7.3 樹脂 取丹參注射液成品 5 mL， 置分液漏斗中， 加三氯甲烷10mL振搖提取， 分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，殘渣加冰醋酸 2 mL使溶解，置具塞試管中， 加水 3 mL， 混勻， 放置 30 min，不得出現沉淀。

1.8 丹參注射液成品中熱原、 異常毒性、 過敏試驗、 溶血與 凝 聚 的測 定［16］熱 原 按 照 《 中 國 藥典》 2010 年版一部附錄 XⅢ A規定的方法進行測定， 劑量按家兔體質量每 1 kg注射1.5 mL。

異常毒性按照 《中國藥典》 2010 年版一部附錄XⅢ E規定的方法進行測定，按靜脈注射法給藥。

過敏試驗按照 《中國藥典》 2010 年版一部附錄XⅢ G規定的方法進行測定。

溶血與凝聚按照 《中國藥典》 2010 年版一部附錄XⅢ H規定的方法進行測定。

2 實驗結果與討論

2.1 丹參2 次醇沉的溫度和 pH條件優化 醇沉所用的乙醇一般在室溫存放。根據醇沉調堿實際操作過程中藥液的溫度， 選取 25、 30、 35 ℃ 3 種條件進行考察。 丹參 2 次醇沉在 pH 8.5， 溫度分別為 25、 30、 35 ℃時， 丹參有效成分收率和總固體除去率見表1。

表 1 pH 8.5 時各種溫度下丹參 2 次醇沉的結果 （n=3）Tab.1 Results of ethanol sediment of Salvia m iltiorrhiza at pH 8.5 and various tem peratures（n=3）

從表 1 可以看出， 藥液 pH 8.5， 溫度從 25 ℃升至30℃， 丹參素鈉、 原兒茶醛、 丹酚酸 B的收率變化不大，總固體除去率變化也不大；但當溫度繼續升高至35℃， 丹參素鈉、 原兒茶醛、 丹酚酸B收率明顯降低，而總固體除去率下降。原因是溫度升高，藥液中溶解的雜質增多。所以藥液溫度升高不利于保留其中的有效成分，也不利于總固體的除去。 在實際生產時， 藥液溫度一般處于常溫25～35 ℃的狀態， 應控制藥液溫度在25 ～30 ℃范圍。

丹參二次醇沉溫度 28 ℃， pH分別為 8.0、8.5、 9.0 時， 丹參有效成分收率和總固體除去率見表2。

表 2 28 ℃時各種 pH下丹參 2 次醇沉的結果 （n=3）Tab.2 Resu lts of ethanol sediment of Salviamiltiorrhiza at 28 ℃ and various pH values（ n=3）

從表 2 可以看出， 藥液溫度 28 ℃，pH從 8.0升至8.5， 丹參素鈉、 丹酚酸 B收率減少， 但總固體除去率增大并高于有效成分的損耗； 當藥液 pH繼續升高至 9.0 時， 總固體除去率明顯增加， 可是丹參素鈉、原兒茶醛收率損失較多，丹酚酸B收率損失最多，遠高于總固體除去率的增加。因此確定優選 pH范圍為8.0 ～8.5。

2.2 丹參水沉的溫度和 pH條件優化 丹參水沉在 pH 2.5， 溫度分別為 20、25、 30 ℃時， 丹參有效成分收率和總固體除去率見表3。

表 3 pH 2.5 時各種溫度下丹參水沉的結果 （n=3）Tab.3 Results of water sediment of Salvia m iltiorrhiza at pH 2.5 and various tem peratures（n=3）

從表 3 可以看出，藥液 pH 2.5， 溫度從 20 ℃升至30℃時， 丹參素鈉、 原兒茶醛、 丹酚酸 B的收率變化很小，總固體除去率的變化也不大，說明水沉調酸時藥液溫度在 20 ～30 ℃范圍對有效成分和總固體的影響較小。在實際生產中，控制藥液溫度在20 ～30 ℃的室溫狀態下進行操作。

丹參水沉溫度 25 ℃， pH分別為 2.0、 2.5、3.0 時， 丹參有效成分收率和總固體除去率見表 4。

表 4 25 ℃時各種 pH下丹參水沉的結果 （n=3）Tab.4 Results of water sediment of Salvia m iltiorrhiza at 25 ℃ and various pH values（ n=3）

從表 4 可以看出， 藥液溫度 25 ℃，pH從 2.0升至2.5， 丹參素鈉、 原兒茶醛的收率變化很小，丹酚酸B的收率增大較多，總固體除去率略有減少。 pH從 2.5 升至 3.0， 丹參素鈉、 原兒茶醛的收率基本上沒有改變，丹酚酸B的收率稍有增加，總固體除去率略有減少。著眼于增加總固體除去率， 工藝優選 pH范圍為 2.0 ～2.2。

2.3 車間生產規模丹參提取優化工藝的驗證 在生產車間按照丹參提取的優化工藝進行驗證實驗，每一批實驗用丹參600 kg， 重復實驗3 次， 結果見表 5， 所得丹參提取液成品的質量見表6。

表 5 車間生產規模驗證丹參提取優化工藝的結果 （n=3）Tab.5 Results of verification experiments about optim ized technology of Salviamiltiorrhiza extraction on shop scale（ n=3）

表6 車間生產規模優化工藝提取的丹參注射液成品質量Tab.6 Qualities of Salviamiltiorrhiza injection extracted with optim ized technology on shop scale

從表6的數據可以看出，按照優化的丹參注射液提取工藝生產的3批成品的各項指標均達到質量控制要求。

3 結論

目前的丹參注射液標準制備工藝中，關于2次醇沉調堿和水沉調酸時溫度和 pH的控制條件， 或者沒有明確規定，或者規定的范圍較寬，致使生產的產品質量不夠穩定。 通過本實驗， 對溫度和 pH控制參數做出明確和細致的規定，在除去固體物質的同時，盡可能保留有效成分。確定丹參2次醇沉調堿的工藝控制參數為藥液溫度 25 ～30 ℃， pH 8.0 ～8.5；丹參水沉調酸的工藝控制參數為藥液溫度 20 ～30 ℃， pH 2.0 ～2.2。 按照優化后的工藝在生產規模制備的丹參注射液質量符合標準要求，操作過程穩定。

從本實驗結果可以看出，丹參注射液的醇沉和水沉過程中有效成分的損失較大。主要原因是醇沉和水沉的分辨率較低，在沉淀雜質的同時，相當多的有效成分也一同沉淀出來。醇沉和水沉后冷藏的時間很長，時間和能源消耗大。在以后的工作中，需要進一步探索更有效的分離方法。

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Extraction technology of Danshen Injection

HUANG He-qing1，2， ZHENG Si-ji2， ZHAO Feng-sheng1*
（1.School of Pharmacy， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200240， China； 2.Shanghai Zhongxi Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201806， China）

Danshen Injection； extraction； ethanol sediment； water sediment

R284.2

： A

： 1001-1528（2014）03-0526-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.017

2013-05-26

黃和清 （1971—）， 男， 碩士生， 研究方向： 中藥制劑生產工藝。

*通信作者： 趙鳳生， 男， 教授， 研究方向： 生物藥物的分離提取。 Tel： （021） 34204528 ， E-mail： fszhao@sjtu.edu.cn