HPLC-UV-ELSD法測定益肝樂顆粒中槲皮素、 山柰素、 柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷d

譚雄斯

（肇慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校， 廣東 肇慶 526020）

［質(zhì) 量］

HPLC-UV-ELSD法測定益肝樂顆粒中槲皮素、 山柰素、 柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷d

譚雄斯

（肇慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校， 廣東 肇慶 526020）

目的 采用 HPLC-UV-ELSD法測定益肝樂顆粒 （垂盆草、 柴胡、 板藍(lán)根等） 中槲皮素、 山柰素、 柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d 的量。 方法 Hypersil C18色譜柱 （4.6mm×150mm， 5 μm） ； 體積流量 0.8mL/min； 槲皮素和山柰素的檢測流動相為甲醇-水-三氟乙酸 （40 ∶60 ∶0.05）， 檢測波長 360 nm。 柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d 的檢測流動相為甲醇-乙腈-水 （25 ∶45 ∶30）， ELSD漂移管溫度 95 ℃， 載氣 （N2） 體積流量 2.4 SLPM/m in。 結(jié)果 槲皮素和山柰素分別在0.071 3 ～1.426 μg（r=0.999 7）、 0.056 8 ～1.136 μg（r=0.999 3） 進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系， 平均加樣回收率分別為 97.73%、 96.97%， RSD （n=6） 分別為 1.63%、 1.52%。 柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d 分別在 0.041 6 ～0.832 0μg（r=0.999 2）、 0.026 7 ～0.534 0 μg（r=0.999 5） 進(jìn)樣量的自然對數(shù)值與峰面積的自然對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系， 平均加樣回收率分別為 97.35%、 98.04%， RSD（n=6） 分別為 0.81%、 1.16%。 結(jié)論 該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好。

益肝樂顆粒； 槲皮素； 山柰素； 柴胡皂苷a； 柴胡皂苷d

益肝樂顆粒為中藥復(fù)方制劑，源于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第四冊，由垂盆草、柴胡、云芝提取物、郁金、板藍(lán)根、五味子等六味藥物組成。具有清熱利濕，舒肝解郁，扶正固本之功效，可用于濕熱蘊(yùn)蒸，身目俱黃，或兩脅痹滿疼痛，體倦懶食，溲赤便溏，舌苔黃膩等，西醫(yī)診斷為急性黃疸型和非黃疸型肝炎，慢性遷延型肝炎等癥的治療［1-2］。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對 該品種進(jìn)行了顯微 鑒別控制，未對方中的任何藥味進(jìn)行定性鑒別或定量測定。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對垂盆草中槲皮素、山柰素和柴胡中柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d 進(jìn)行定量測定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，能有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，確保人民用藥安全有效。

1 材料

高效液相色譜儀 （日本島津 LC-10ATVP型，島津自動進(jìn)樣器 SIL-10ADVP）； ANASTAR色譜數(shù)據(jù)工作站； 紫外可見檢測器 （型號 SPD-1OAVP）；Alltech 2000ES 型 蒸 發(fā)光 散 射 器； 槲 皮 素 對 照 品（批號為 100081-200406）、 山柰素對照品 （批號為110861-200405）、 柴 胡 皂 苷 a對 照 品 （ 批 號 為110777-200405） 和柴 胡皂苷 d 對 照品 （ 批號為110778-200404） 均購于中國食品藥品檢定研究院；益肝樂顆粒 （10 g/袋；批號為 130412， 130420，130424） 購于吉林益民堂制藥有限公司； 甲醇、乙腈 （色譜純， 安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司）， 三氟乙酸 （色譜純，科密歐化學(xué)國際有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 槲皮素和山柰素的測定［3-12］

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Hypersil C18色譜柱 （4.6 mm×150 mm， 5 μm）；流動相為甲醇-水-三氟乙酸 （40 ∶60 ∶0.05）； 體積流量為 0.8 m L/min， 檢測波長 360 nm。 在此條件下槲皮素和山柰素與其他組分基線分離良好，以槲皮素計理論塔板數(shù)應(yīng)不低于 3 000。

2.1.2 檢測波長的選擇 分別取槲皮素和山柰素對照品適量， 加流動相溶解制成每 1 mL含 0.05 mg的溶液， 按紫外-可見分光光度法在 300 ～500 nm波長處進(jìn)行紫外掃描， 結(jié)果槲皮素和山柰素對照品均在 360 nm處有最大吸收， 參照 《中國藥典》 2010 年版一部垂盆草藥材檢驗(yàn)項下的檢測波長 360 nm， 故檢測波長定為 360 nm。

2.1.3 對照品混合溶液的制備 精密稱取槲皮素和山柰素對照品適量， 置 100 m L量瓶中， 加甲醇-25%鹽酸溶液 （4 ∶1） 混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品混合溶液 （槲皮素為0.071 3 mg/mL和山柰素 0.056 8 mg/mL）。

2.1.4 供試品溶液的制備 取本品適量， 研細(xì)，取約 5.0 g， 精密稱定， 精密加入甲醇-25%鹽酸溶液 （4 ∶1）混合溶液 50 mL， 稱定質(zhì)量，超聲 （功率 250W， 頻率 35 kHz）處理 20min，放冷， 再稱定質(zhì)量， 用甲醇-25%鹽酸溶液 （4 ∶1） 混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.5 陰性對照溶液的制備 按益肝樂顆粒處方比例稱取適量除垂盆草的其余藥味，按益肝樂顆粒的前處理和制劑生產(chǎn)工藝制成缺垂盆草的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺垂盆草的陰性對照溶液。

2.1.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品混合溶液 1、 5、 10、 15、 20 μL， 按 “2.1.1” 項下的色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，槲皮素、山柰素量為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，槲皮素回歸方程為 Y=3.763 1 ×106X-1 288.1， r= 0.999 7； 山柰素為 Y=4.010 8 ×106X+567.9， r= 0.999 3。結(jié)果表明槲皮素在 0.071 3 ～1.426 μg進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好；山柰素在 0.056 8 ～1.136 μg進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.7 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取 10 μL的供試品溶液、對照品溶液及陰性對照溶液，按“2.1.1” 項的色譜條件進(jìn)行色譜分析，結(jié)果供試品溶液色譜中，在與槲皮素和山柰素對照品相同保留時間處有吸收峰，而陰性對照溶液在相同保留時間處未顯吸收峰， 見圖1。

2.1.8 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液 （批號130412）， 在放置0、 1、 2、 4、 6、 8 h 后精密吸取10 μL進(jìn)樣， 測定其峰面積值， 槲皮素 RSD為0.59%， 山柰素 RSD為 0.76%。結(jié)果表明， 供試品溶液8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.9 精密度試驗(yàn) 取對照品混合溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次， 按 “2.1.1” 項的色譜條件測定槲皮素和山柰素的峰面積，結(jié)果表明，儀器精密度良好，槲皮素 RSD為 0.94%，山柰素 RSD為 0.81%。

2.1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一個批號樣品 （批號130412）， 按上述方法制備 6 份供試品溶液， 分別測定，結(jié)果槲皮素和山柰素 RSD分別為 0.53%、0.72%。 結(jié)果表明本方法具有良好的重復(fù)性。

圖1 槲皮素和山柰素的 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatgrams of quercetin and kaempferol

2.1.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量 （槲皮素0.69 mg/g、 山柰素0.57 mg/g） 的的同一批樣品（批號 130412） 適量， 研細(xì)， 取約 2.5 g， 精密稱定， 分別精密加入對照品混合溶液 25 mL、甲醇-25%鹽酸溶液 （4 ∶1） 混合溶液 25 mL， 按照“2.1.4” 項制備加樣供試液。 精密吸取加樣供試液 10 μL， 按上述測定方法測定其峰面積， 計算回收率， 結(jié)果表明本方法回收率良好， 見表1。

2.2 柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d 的測定［13-23］

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Hypersil C18色譜柱 （ 4.6 mm ×150 mm， 5 μm）； 甲 醇-乙 腈-水（25 ∶45 ∶30） 為流動相， 柱溫為室溫； 體積流量0.8 mL/min； 進(jìn) 樣量 10μL。 ELSD檢 測器檢測參數(shù)： 漂移管溫度 95 ℃， 載氣 （N2） 體積流量 2.4 SLPM/min。 理論塔板數(shù)以柴胡皂苷 a計算應(yīng)不低于 4 000。

2.2.2 對照品混合溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a對照品和柴胡皂苷d對照品各適量， 加甲醇制成對 照 品 混 合 溶 液 （ 柴 胡 皂 苷 a為 0.041 6 mg/mL， 柴胡皂苷 d 為 0.026 7 mg/m L）。

表1 槲皮素和山柰素回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests for quercetin and kaempferol

2.2.3 供試品溶液的配制 取本品適量， 研細(xì)，取約5.0 g， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 加甲醇50 mL， 超聲處理 （250 W， 30 kHz） 20 min， 用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL， 置水浴上蒸干， 殘渣加水 15 mL溶解， 溶液加于 AB-8 大孔樹脂柱 （120 mm×10 mm） 上，分別以100 mL的氨試液、水、 50%乙醇洗脫， 棄去洗脫液，再用乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至干， 殘渣用甲醇溶解， 移至10 mL量瓶中， 稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的配制 按益肝樂顆粒處方比例稱取適量除柴胡的其余藥味，按益肝樂顆粒的前處理和制劑生產(chǎn)工藝制成缺柴胡的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺柴胡的陰性對照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品混合溶液1、 5、 10、 15、 20 μL， 按上述色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積的自然對數(shù)值為縱坐標(biāo)，柴胡皂苷a、 柴胡皂苷d量的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得回歸方程。柴胡皂苷 a為 Y=1.364 2X+ 7.614 7，r=0.999 2；柴胡皂苷 d 為 Y=1.069 1X+ 5.095 4， r=0.999 5。 結(jié) 果 表 明 柴 胡 皂 苷 a在0.041 6 ～0.832 0 μg進(jìn)樣量的自然對數(shù)值與峰面積的自然對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系；柴胡皂苷d在0.026 7 ～0.534 0 μg進(jìn)樣量的自然對數(shù)值與峰面積的自然對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 陰性對照試驗(yàn) 分別精密吸取10 μL的供試品溶液、對照品溶液及陰性對照溶液，按“2.2.1” 項的色譜條件進(jìn)行色譜分析，結(jié)果供試品溶液色譜中，在與柴胡皂苷a對照品和柴胡皂苷d對照品相同保留時間處有吸收峰，而陰性對照溶液在相同保留時間處未顯吸收峰，見圖2。

圖2 柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d的 ELSD圖Fig.2 ELSD chromatogram s of saikosaponin a and saikosaponin d

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取對照品混合溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次， 按 “2.2.1” 項的色譜條件測定柴胡皂苷 a和柴胡皂苷d的峰面積，測試結(jié)果表明儀器精密度良 好， 柴 胡 皂 苷 a 和 d 的 RSD 分 別 為0.61%、 0.85%。

2.2.8 重 復(fù) 性 試 驗(yàn) 取 同 一 批 樣 品 （ 批 號130412），按上述方法制備 6 份供試品溶液， 分別測定， 柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d 的 RSD分別為0.91%、 0.76%。 結(jié)果表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.9 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液 （批號130412），在放置0、 1、 2、 4、6、 8 h 后， 測定其峰面積值，柴胡皂苷 a的 RSD為 0.57%，柴胡皂苷 d 的 RSD為 0.68%， 供試品溶液 8 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同一批樣品 （批號 130412， 柴胡皂苷 a為 0.17 mg/g、柴胡皂苷 d 為 0.11 mg/g） 適量， 研細(xì)， 取約 2.5 g，精密稱定， 置錐形瓶中， 分別精密加入甲醇 40 mL， 加對照品混合溶液 10 mL，按 “2.2.3” 項下供試品溶液配制方法制成加樣供試液，按上述測定方法測定其峰面積，計算回收率，結(jié)果表明本方法回收率良好，見表2。

表2 柴胡皂苷 a和 d加樣回收率結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for saikosaponin a and saikosaponin d

2.3 樣品測定 取 3 批樣品按 “2.1” 項下槲皮素和山柰素測定方法，分別精密吸取對照品混合溶液和供試品溶液各10 μL， 注入液相色譜儀， 測定槲皮素和山柰素的量， 結(jié)果見表3。

取3 批樣品按 “2.2” 項下柴胡皂苷 a和柴胡皂苷d測定方法，分別精密吸取對照品混合溶液5 μL、 10 μL和供試品溶液 10 μL， 注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程分別測定本品中柴胡皂苷 a和柴胡皂苷d的量， 結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果 （， n=3）Tab.3 Results of content determ ination（，n=3）

表3 樣品測定結(jié)果 （， n=3）Tab.3 Results of content determ ination（，n=3）

批 號 槲皮素 /（ mg·g-1） 山 柰素 /（ mg·g-1） 柴 胡皂 苷 a/（ mg·g-1） 柴胡皂 苷 d/（ mg·g-1）130412 0.69 ±0.006 7 0.57 ±0.004 2 0.17 ±0.001 5 0.11 ±0.000 6 130420 0.71 ±0.004 0 0.58 ±0.003 5 0.17 ±0.001 5 0.11 ±0.001 0 130424 0.73 ±0.003 8 0.59 ±0.004 6 0.18 ±0.001 5 0.12 ±0.001 0

3 討論

3.1 垂盆草為方中主要藥物之一， 具有利濕退黃，清熱解毒之功效，可用于濕熱黃疸，小便不利，癰腫瘡瘍等癥狀的治療；《中國藥典》 2010 年版僅對垂盆草中的槲皮素、山柰素和異鼠李素的總量進(jìn)行了控制，未分別對各成分進(jìn)行定量分析，本實(shí)驗(yàn)中曾對益肝樂顆粒所含垂盆草中3種成分分別進(jìn)行定量測定研究，但因該制劑中異鼠李素含有量偏低，所采用的色譜條件下異鼠李素與其他成分分離效果不佳，故本實(shí)驗(yàn)僅對垂盆草中槲皮素和山柰素進(jìn)行了定量控制，未將異鼠李素作為該制劑定量控制指標(biāo)。

3.2 ELSD是一種通用型檢測器， 流動相由熱氣流使之熱氣化噴霧，再進(jìn)入加熱管，溶劑在此揮發(fā)。所得分析檢測的物質(zhì)顆粒通過一狹窄光束散射光， 由光電倍增管收集。 ELSD的響應(yīng)取決于被分析物質(zhì)顆粒的數(shù)量和大小。 由于 ELSD僅對不揮發(fā)被分析物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng).即使是在梯度洗脫時也能提供平衡的基線。 ELSD已成功用于皂苷、 生物堿、萜類內(nèi)酯、氨基酸和糖類等分析，是分析無紫外吸收及紫外吸收弱成分的有力工具。柴胡為方中主要藥物之一，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣之功效，可用于感冒發(fā)熱，寒熱往來，胸脅脹痛，月經(jīng)不調(diào)，子宮脫垂，脫肛等癥狀的治療；同時柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為柴胡的主要成分。 本實(shí)驗(yàn)采用 HPLC-ELSD法對柴胡中柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d進(jìn)行測定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供重要依據(jù)。

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Determ ination of quercetin， kaemp ferol， saikosaponin a and saikosaponin d in Yiganle Granules by HPLC-UV-ELSD

TAN Xiong-si
（Zhaoqing Medical College， Zhaoqing 526020， China）

AIM To develop an HPLC-UV-ELSD method for determining the content of quercetin， kaempferol， saikosaponin a and saikosaponin d in Yiganle Granules（Sedi Herba， Bupleuri Radix，Isatidis Radix， etc.） . METHODS An Hypersil C18column was used as the chromatographic column，the flow rate was 0.8 mL/min. Themobile phase for quercetin and kaempferol consisted ofmethanol-water-trifluoroacetic acid （40 ∶60 ∶0.05 ） . The UV detection wavelength was set at360 nm.Themobile phase for saikosaponin a and saikosaponin d consisted ofmethanol-acetonitrile-water（ 25 ∶45 ∶30 ），the temperature of drift tube was set at 95 ℃， and the gas flow（ N2） at2.4 SLPM/min.RESULTS Therewas a good linear relationship between the concentration ofquercetin，kaempferol and peak area value at the concentrations of0.071 3-1.426 μg（r=0.999 7） ， and 0.056 8-1.136 μg（ r=0.999 3） .The average recovery were 97.73% （ RSD=1.63%） and 96.97% （RSD=1.52%）， respectively.There was a good linear relationship in the concentrations of saikosaponin a and saikosaponin d at the concentration of0.041 6-0.832 0 μg（r=0.999 2）， 0.026 7-0.534 0 μg（r=0.999 5）.The average recoveries were 97.35% （RSD=0.81%） and 98.04% （ RSD=1.16%） ， respectively.CONCLUSION The method is accurate， sensitive， reproducible and can be used in the determination of quercetin， kaempferol， saikosaponin a and saikosaponin d in Yiganle Granules.

Yiganle Granules；quercetin； kaempferol； saikosaponin a； saikosaponin d

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）03-0531-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.018

2013-06-08

譚雄斯 （1979—） ， 男， 碩士， 藥師， 主要從事藥學(xué)教育和研究。 Tel： 13450185366， E-mail： tanxiongsi2013@163.com