虛擬篩選預測固本止咳膏的作用靶標

陳海燕， 李秉佳， 史勝楠

（廣西大學化學化工學院， 廣西 南寧 530004）

虛擬篩選預測固本止咳膏的作用靶標

陳海燕， 李秉佳， 史勝楠

（廣西大學化學化工學院， 廣西 南寧 530004）

目的 應用虛擬篩選方法預測固本止咳膏的活性成分及其作用靶標，以期闡明固本止咳膏活性成分的協同機制。 方法 通過文獻收集固本止咳膏復方原材料有關的 117 個化合物。 選取三個炎癥中關鍵酶 6COX、 1A4G、 1LRY作受體， 應用 iGEMDOCK軟件對 117 個化合物分子進行分子對接， 發現了 19 個活性分子。 再用 SePreSA進行反向分子對接預測這些活性成分的作用靶標。結果 預測了固本止咳膏中活性成分及其分子靶標。結論 初步闡釋固本止咳膏在抗炎、抗菌和抗病毒方面的作用機制，為下一步研究壯藥固本止咳膏的作用靶標選取提供理論指導，為復方壯藥開發提供一種新的研究策略。

壯藥；固本止咳膏；活性成分；虛擬篩選；分子對接；作用靶標

固本止咳膏源于壯族秘方，以白蟻菌圃與黃芪、五味子、淫羊藿、矮地茶、苦杏仁配伍而成［1］，具有止咳祛痰的作用［2］。 既往對其原材提取物的成分和藥效已有研究［3-4］， 其中 主藥白蟻菌圃具有抗炎、 增強免疫力 等作用［5-6］， 但對 其活性成分分子作用機制尚不明確。這也是壯族醫藥現代化開發和推廣的常見問題，而對活性成分的研究有助于提高質量控制和增強藥物安全，更可使之與國際標準接軌，推動其得到廣泛應用。

囿于固本止咳膏原藥材成分復雜，若運用傳統的藥理研究方法破譯難度高、周期長、投資大，而使用計算機輔助藥物設計 CADD技術可避免此問題。隨著將虛擬篩選和高通量篩選結合，新配體識別的技術得到發展［7］。 同時， 虛擬篩選能較好地從化合物中篩選出活性成分［8］。 本實驗利用挖掘文獻的方法和虛擬篩選工具結合，篩選固本止咳膏原藥材中具有抗炎活性的分子并預測其作用靶標，以期闡明固本止咳膏活性成分的分子協同機制，為民族醫藥的現代化開發奠定理論基礎。

1 方法

1.1 材料

1.1.1 配體庫的構建 本實驗以固本止咳膏原藥材中化學成分為研究對象， 通過文獻 ［9-11］ 挖掘共計 117 個化合物。 化合物分子采用 Chem Office、Open Babel（http： //openbabel.org） 等構建成三維結構， 并對 其加氫、 加電荷，保 存 為 mol2 格式，作為虛擬篩選的配體庫。

1.1.2 受體選擇 咳嗽痰飲的臨床表現有咳痰、哮喘、咳嗽。主要病因是細菌、病毒感染，真菌、衣原體、支原體致使上呼吸道炎癥，發展到喉、氣管、肺部等病變。故而從蛋白質晶體結構數據庫（http： //www.rcsb.org） 中選擇在炎癥的表達和調節 中 關 鍵 酶 COX-2 為 受 體 蛋 白 （ PDB code：6COX［12］）。 同時， 選取兩個病毒和細菌合成的關鍵酶神經氨酸苷酶 （ PDB code：1A4G［13］）、 肽脫甲酰化酶 （ PDB code： 1LRY［14］） 作為受體蛋白。

1.2 方法

1.2.1 分子對接和評價方法 分子對接是將化合物分子放入受體蛋白配體結合位點，通過研究受體結構特征及其與化合物分子之間作用力，依據讓兩者在幾何、能量上匹配的原則而相互識別，篩選出結合能量最低的分子［15］。

采用 iGEMDOCK［16］（ GA parameters： Population size=200， Generation=70， Number of solution= 2， Binding site radius=8?） 對化合物分子和受體蛋白的結合腔穴進行對接。蛋白質上基團通過范德華力、氫鍵和靜電作用與化合物分子結合，匹配出能力最低的結合位點。能量函數根據對分子對接結果的范德華力、氫鍵和靜電作用統計，并將能量轉換成單位 kcal/mol。

1.2.2 作用靶標預測 活性分子之間， 具有共同特征的如化學基團、 氫鍵給/受體、 正/負電基團和疏水性基團等，以化合物分子的結構信息和生物活性為基點，找到共同的藥效作用本質。作用靶標預測是在不知靶點情況下，讓活性分子和有可能的多個靶標的三維結構對接， 尋找潛在靶標［17］。

通過 SePreSA （ http： //sepresa.bio-x.cn/） 服務器，將化合物分子的三維結構上傳，服務器將化合物分子和蛋白質晶體結構數據庫中蛋白質進行結合。篩選出對化合物分子有敏感作用的氨基酸殘基，以期闡明化合物分子在產生藥效過程中的副作用及解釋其中藥物動力學，評估化合物分子的安全性［18］。

2 結果

2.1 以 1A4G、 1LRY、 6COX為受體， 通過將化合物分子與之對接， 篩選出打分排在前19的分子，以 ZMR［19］、 BB2［20］、 SC58［21］為 對接結果陽 性 對照， 并對其進行排序 （見表1）， 能量較低者表示化合物分子與受體結合的構象穩定，發生的作用可能性大，而且多數分子的對接能量比相應的陽性對照物的能量要大，即可成為相關酶的抑制劑。

表1 分子對接數據Tab.1 Docking score

2.2 藥物的潛在靶標的識別對于藥物的研發、使用過程中的分子生理活性和毒性等有重要意義。同時，據此能挖掘藥物的適用性，有利于其在老藥新用等領域的發展。作為一種快速而低成本的技術，計算機輔助識別分子靶標的算法應用甚廣，根據SePreSA服務器所設定算法［18］，選出結果 Z'-scores＜-0.5 且 Z-scores＜-1.2 的靶標 （ 見表 2）。

3 討論

固本止咳膏6種原藥材化學成分復雜，其中黃芪、五味子等在方劑配伍使用較多。采用單一藥材的研究不足以體現中藥復方的系統性。中藥有“藥有個性之長，方有合群之妙” 的說法，即配伍藥材之間存在相互協同效用。依靠對中藥成分的分離提純后進行藥理實驗流程復雜、周期長、成本高，只能適用小規模篩選。利用計算機虛擬篩選的方法實驗具有導向性，加快了中藥復方的機理研究過程［22］。 中藥方劑青黛片治療急性早幼粒白血病的分子機理的分析，首次闡述方劑 “君、 臣、佐、使” 的配伍原則［23］。

表2 作用靶標預測結果Tab.2 Result of virtual screening

固本止咳膏作為傳統壯藥，其原藥材的鑒定和分析的深入研究已有報道，中藥配伍對化學成分的影響指出合理的方劑有助于藥效的釋放［24］。 但囿于客觀條件，依據傳統方法弄清化合物分子的生理活性仍是一項困難的工作。文中數據表明，打分排在前的化合物分子在與 COX-2 結合具有穩定構象，君藥白蟻菌圃中的 Ursolic acid、 佐藥苦杏仁、 矮地茶中的 Amygdalin、 Quercetin、 Kaempferol等指出方劑止咳祛痰的活性成分，驗證了其傳統醫理中具有治療炎癥的作用。 而臣藥黃芪的 Rutin 和五味子中木脂素類化合物與神經氨酸苷酶、肽脫甲酰化酶的對接結果說明其在抗菌和抗病毒方面也具有療效，補充解釋方劑效用。

同時，研究中發現潛在的作用靶標中涉及藥效范圍面廣， 如蛋白質 Poly［ADP-ribose］ polymerase 1 具有生理毒性等。 由蛋白質 Mitogen-activated protein kinase 1 （MAPK） 形成的信號通路， 接受外界刺激可調節真核生物基因表達，化合物分子與之結合而影響真核生物的生長發育、分化凋亡。方劑中的化合物分子通過分子間作用力與之結合，作為潛在的抑制劑，或可改變調節機制。我們也注意到化合物分子能與蛋白質 Histamine N-methyltransferase（HMT） 結合而影響 HMT對組胺代謝的作用。 表明使用固本止咳膏的使用可能影響組胺參與睡眠和食欲調節的功能，是潛在的藥物安全性能的指標。

方劑與其他藥物混合使用時存在藥物的協同拮抗作 用。 如 蛋 白 質 Arylamine N-acetyltransferase 2（NATs） 可與化合物 Deoxyschizandrin、 Schisandlignan A等結合， 從而影響 NATs催化基于輔酶 A乙酰化致癌芳香胺類化合物的過程，拓展了對癌病發病和抗癌藥物的代謝機制的研究。Anwuweizic acid在抑制蛋白質 Cholinesterase的同時， 延緩了可卡因代謝，也增加了可卡因使用的潛在風險。據此，固本止咳膏除了在抗炎病癥上能發揮作用外尚有治療其他病癥的效用等待發掘。

值得注意的是，實驗中只對固本止咳膏原材中的117 個化合物分子進行了研究， 同時也只挑選了炎癥中的3個關鍵酶，這顯然是不夠的。藥物在人體代謝過程的機制等很多問題尚待深入研究。

4 結論

本實驗確定了固本止咳膏中抗炎、抗菌和抗病毒的主要活性成分以及其主要的作用靶標，這有助于闡釋固本止咳膏的分子作用機制，明確臨床定位和提高臨床有效性及安全性評價與合理用藥，并為中藥復方和壯族傳統醫藥提供一個新的研究策略，使用計算機從復雜體系中虛擬篩選出活性成分的方法簡單、周期短，從而減低研究費用，提高研究效率。

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Predicting target of Guben Zhike Electurary by virtual screening

CHEN Hai-yan， LIBing-jia， SHISheng-nan
（1.School of Chemistry&Chemical Engineering， Guangxi University， Nanning 530004， China）

AIM In order to elaborate the collaborativemechanism of active compounds in Guben Zhike Electurary， amethod of virtual screeningwas proposed to forecast Guben Zhike Electurary’s active compounds and targets.METHODS Firstly， 117 compounds of Guben Zhike Electurary were collected through literature and other materials.Secondly， the 19 active compounds were found in the 117 compounds， which were docked with 3 key enzymes（pdb code： 6COX， 1A4G and 1LRY， which was the targetof the anti-inflammatory， antibacterial and antiviral， respectively） by iGEMDOCK.Finally， the 19 active compounds'targetswere predicted by the reverse docking software SePreSA.RESULTS Active compounds and targetof Guben Zhike Electurary were confirmed.The mechanism of action in anti-inflammatory， antibacterial and antivirus were explained.CONCLUSION All above will lay the foundation of further study of Guben Zhike Electurary， and provide new strategies ofmodern development of compound of Zhuangmedicine at the same time.

Zhuangmedicine；Guben Zhike Electurary； active compounds；virtual screening； dock； target

R284.1； R289.9

： A

： 1001-1528（2014）03-0559-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.024

2013-05-09

梧州市科技局-廣西大學校市對接項目 （2011）

陳海燕 （1976—） ， 男， 博士， 副教授， 從事天然產物研究與開發、 中藥現代化。 E-mail： czyzsu@163.com