骨通貼膏指紋圖譜及化學成分研究

夏 菁， 謝媛媛， 張宗璇， 張延惠， 王義明， 梁瓊麟， 羅國安*

（1.江西中醫學院， 江西 南昌 330004； 2.清華大學化學系， 北京 100084； 3.中國藥科大學， 江蘇 南京210009； 4.桂林天和藥業股份有限公司， 廣西 桂林 541001）

骨通貼膏指紋圖譜及化學成分研究

夏 菁1，2， 謝媛媛2*， 張宗璇3， 張延惠4， 王義明1，2， 梁瓊麟2， 羅國安1，2*

（1.江西中醫學院， 江西 南昌 330004； 2.清華大學化學系， 北京 100084； 3.中國藥科大學， 江蘇 南京210009； 4.桂林天和藥業股份有限公司， 廣西 桂林 541001）

目的 應用 HPLC法建立骨通貼膏 （丁公藤、 麻黃、 當歸、 干姜等） 指紋圖譜并結合兩種 LC/MS 聯用技術進行多成分結構鑒定。 方法 以 AlltimaTMC18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） 為分析柱， 0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫， 檢測波長為 280nm； 質譜定性采用飛行時間質譜 （TOF-MS） 結合離子阱多級質譜 （ Ion-trap/MSn）， 正、負兩種離子模式掃描。 結果 以 Z-藁本內酯為參照物峰， 確定了骨通貼膏 HPLC指紋圖譜， 指定了 19 個共有峰 （21個化學成分）， 10 批骨通貼膏 HPLC指紋圖譜相似度大于 0.990。 結論 所建立骨通貼膏指紋圖譜分析方法簡單準確，穩定可靠，可用于其質量評價。

骨通貼膏；指紋圖譜；高效液相色譜；飛行時間質譜；離子阱多級質譜

骨通貼膏由丁公藤、麻黃、當歸、干姜、白芷、海風藤、乳香、三七、姜黃、辣椒、樟腦、肉桂油、金不換、薄荷腦等多味藥材制備而成，輔料為橡膠、氧化鋅、松香、羊毛脂、黃凡士林、月桂氮酮，具有祛風散寒、活血通絡、消腫止痛的功效。現行的骨通貼膏質量標準收載于國家食品藥品監督管理局國家藥品標準 WS3-120 （Z-024） -2000（Z） -2010［1］，在 【鑒別】項下僅以東莨菪內酯、延胡索乙素、樟腦、薄荷腦及肉桂醛等對照品及當歸對照藥材等為指標進行薄層色譜或氣相色譜鑒別，在 【含量測定】 項下利用薄層掃描法測定麻黃中鹽酸麻黃堿的量，檢測指標較少，且存在分析方法落后，操作復雜，檢測靈敏度低等缺陷，難以全面表征骨通貼膏全面質量。

中藥指紋圖譜具有整體宏觀和半定量分析等特點，是目前能夠為國內外廣泛接受的一種中藥質量評價技術［2］， 它克服了僅僅依賴一種或幾種指標成分的物理化學性質鑒別中藥質量的局限性，從整體層面全面、 準確地體現中藥質量［3］。 液相色譜-質譜聯用技術 （LC-MS） 在中藥復雜體系化學成分快速分離和鑒定方面已得到廣泛應用。其中，液相色譜用于分離復雜成分，多種質譜聯合檢測用于化學成分鑒定。 飛行時間質譜 （TOF/MS） 與離子阱質譜 （Ion-trap/MSn） 聯合應用是復雜樣品成分鑒定的有效方法， TOF/MS 提供精確質量數， Iontrap/MSn可提供化合物的碎片信息用于結構解析，在中藥缺少對照品的情況下，能較準確地獲得復方中的化學成分信息［3-7］。

本實驗采用 HPLC法建立了骨通貼膏的指紋圖譜，經方法學驗證，該方法具良好的重復性，符合指紋圖譜測定要求，運用國家藥典委員會研發的相似度計算軟件， 對 10 批次的骨通貼膏指紋圖譜進行了相似度評價， 結果相似度良好； 并通過 HPLCTOF/MS 及 HPLC-ion-trap/MSn聯用技術對骨通貼膏中主要化學成分進行分析鑒定，為骨通貼膏的全面質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-2010A 色譜儀， 配有二元梯度 泵 LC-20AT， 二極 管 陣 列檢測器 SPDM20A， LC solution 色譜工 作站 （ SHIMADZU， Japan） ； Agilent 1200 LC/MSD TOF高效液相色譜-飛行時間質譜連用儀， 配有二元梯度泵 G1312A， 二極管陣列檢測器 G1315D， 電噴霧離子源 （ESI）（Agilent， USA）；Agilent 1100 series LC/MSD Trap高效液相色譜-離子阱質譜聯用儀， 配有二元梯度泵 G1312A， 二極管陣列檢測器 G1328A， 電噴霧離子源 （Agilent，USA）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿有限公司）； DLSB-10L/10低溫冷卻液循環泵及 HH-S 型水浴鍋 （鞏義市予華儀器有限責任公司）； RQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； Milli-Q Synthesis超純水純 化系 統 （ Millipore， USA）， 0.45 μm 濾 膜（天津津騰實驗設備有限公司）。

1.2 試劑與樣品 Z-藁本內酯對照品 （四川維克奇生物科技有限公司， 純度≥98%）； 洋川芎內酯I、 洋川芎內酯 H對照品 （鼎瑞化工有限公司， 純度≥98%）。 甲酸、 無水乙醇、 三氯甲烷 （分析純， 北京化工廠）； 乙腈 （色譜純， Merck KGaA）；Milli-Q超純水 （自制）。 骨通貼膏共計 10 批 （批號分別為 20090449，20091006， 20090903，20090913，20090818， 20090933， 20090944， 20090707， 20090508，20090327）， 均由桂林天和藥業股份有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 AlltimaTMC18色譜 柱 （4.6 mm× 250 mm， 5 μm）； 流動相 A為 0.1%甲酸水溶液，流動 相 B為 乙 腈， 梯 度 洗 脫； 體 積 流 量 1.0 mL/min；柱 溫 25 ℃； 檢 測 波 長 280 nm。進 樣量 5 μL。

2.2 質譜條件

2.2.1 飛行時間質譜 電噴霧離子源 （ESI）； 采用正、負兩種離子模式采集數據；質量掃描范圍為50 ～2 200 m/z； 干燥氣體積流量為 10 L/min； 干燥氣溫度為 350 ℃； 霧化氣壓為 35 psi（1psi= 6.895kPa）； 毛細管電壓在正模式下為4 000 V， 負模式下為 3 500 V； 碎裂電壓 175 V； Skimmer電壓60 V； 八級桿 DC1 電壓 -38.0 V；八級桿射頻電壓250 V； 采用分流比設置， 分流比為 1 ∶4； 試驗數據采用 Analyst QS 軟件處理。 測定樣品之前， 使用校正液校準質量軸，以保證質量精度誤差小于5 ppm； 元素組成計算參數設定如下： C≤60，H≤100， O≤30， N≤2， 環加雙鍵數0 ～30； 容許質量范圍100 ppm。

2.2.2 離子阱質譜 電噴霧離子源 （ESI）； 采用正、負兩種離子模式采集數據；自動二級碎片分析； 質量掃描范圍為 50 ～2 200 m/z； 干燥氣體積流量為 10 L/min； 干燥氣溫度為 350 ℃； 霧化氣壓為 35 psi； 毛細管電壓在正模式下為 4 000 V， 負模式下為3 500 V； 碎裂電壓為 1.0 V； ICC目標參數為30 000， 累積時間為 200 ms； 采用分流比設置，分流比為 1 ∶4； 試驗數據采用 Agilent化學工作站Rev.A.09.01 軟件處理。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取 5.0 mg Z-藁本內酯對照品于10 mL量瓶中， 用無水乙醇溶解并定容配成質量濃度為 0.5 mg/mL的 Z-藁本內酯對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 取本品 2 片， 除去蓋襯，剪成小塊， 置 250 mL具塞錐形瓶中， 加三氯甲烷50 mL， 超聲溶脫 30 min， 加無水乙醇 100 mL， 搖勻，放置使溶液澄清，濾過，減壓蒸干濾液，殘渣用無水乙醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度， 搖勻， 經 0.45 μm微孔濾膜過濾， 作為供試品溶液。

2.5 測定方法 分別精密量取對照品溶液及供試品溶液5 μL進樣， 以 Z-藁本內酯的色譜峰為參照峰，其余共有峰的保留時間和峰面積與之比值分別為相對保留時間和相對峰面積。

2.6 精密度試驗 取同一批號 （批號 20090449）的供試品溶液， 按 “2.1” 項色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖，考察各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果表明，色譜圖中各共有峰相對保留時間的 RSD為 0.04% ～0.57%，相對峰面積的 RSD為 1.83% ～4.80%，表明本儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批號 （批號 20090449）骨通貼膏， 重復制備 6 份供試品溶液，按 “2.1”項色譜條件進樣測定6次，記錄色譜圖，考察各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果表明， 色譜圖中各共有峰相對保留時間的 RSD為0.04% ～0.97%，相對峰面積的 RSD為 1.25% ～4.59%， 表明重復性良好。

2.8 穩定性試驗 取同一批號 （批號 20090449）的供試品溶液， 按 “2.1” 項色譜條件分別在 0、2、 4、8、 12、24 h 進樣測定，記錄色譜圖， 考察各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果表明，色譜圖中各共有峰相對保留時間的RSD為 0.04% ～0.62%， 相對峰面積的 RSD為1.82% ～4.66%，表明供試品溶液在常溫條件下可在24 h內保持穩定。

2.9 對照指紋圖譜的生成及 10 批骨通貼膏指紋圖譜相似度評價 利用上述指紋圖譜測定方法，對10 批骨通貼膏進行指紋圖譜檢測，標定了 19 個共有峰， 見圖 1、圖 2。 利用國家藥典委員會 《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統 2004A版》 對 10 批骨通貼膏指紋圖譜進行匹配， 以批號 20090449 色譜圖為參照圖譜， 設置時間窗為 0.1，采用中位數法生成骨通貼膏對照指紋圖譜 （見圖 1）。 計算 10批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，結果見表 1。 結果表明 10 批骨通貼膏指紋圖譜相似度均大于 0.990， 相似度良好， 說明 10 批骨通貼膏質量穩定。

2.10 骨通貼膏化學成分分析 利用 HPLC-TOF/ MS 及 HPLC-ion-trap/MSn對骨通貼膏供試品溶液進行正、負離子掃描，兩種模式下的總離子流圖（見圖3） 顯示各化學組分在不同掃描模式下響應強度不一，因此對正離子和負離子兩種模式進行采集，使獲得的化合物信息互補。根據文獻建立組方藥材的化學成分信息庫［8-13］， 利用 TOF/MS 獲得的精確相對分子質量信息及 Ion-trap/MSn獲得的多級碎片信息與庫中成分進行比對，鑒定骨通貼膏化學成分，同時對色譜峰進行藥材歸屬。通過以上方法， 本實驗解析了骨通貼膏色譜圖中 21個化學成分，分別歸屬于丁公藤、麻黃、當歸、白芷、金不換、 海風藤、三七、 干姜、姜黃、 辣椒10味藥材，結果見圖3及表2。

圖1 骨通貼膏對照指紋圖譜Fig.1 Reference fingerp rint of Gutong Plsater

圖 2 10 批骨通貼膏指紋圖譜Fig.2 Fingerprints of 10 batches of Gutong Plsater

表 1 10 批骨通貼膏 HPLC指紋圖譜相似度Tab.1 Sim ilarities of fingerprint for 10 batches of Gutong Plsater

圖 3 骨通貼膏 TOF/MS總離子流圖 （TIC） 及 HPLC色譜圖Fig.3 TOF/M S total ion ch romatogram s（ TIC） and HPLC chromatogram of Gutong Plsater

3 討論

3.1 在供試品制備方法的考察中，本研究分別對不同提取溶劑 （乙醇、 甲醇、 丙酮）， 不同提取方法 （超聲、 熱回流）和不同提取時間 （15 min、30 min、45 min、60 min） 進行了考察，并參照中藥指紋圖譜信息 “最大化” 原則，確定了供試品溶液的制備方法。

3.2 在色譜分析中， 流動相體系對色譜分離影響較大。 本實驗分析測試了水-乙腈、 0.1%甲酸水-乙腈、 0.1%磷酸水-乙腈體系下骨通貼膏色譜圖，通過比較發現流動相中加入一定比例的酸，可有效改善色譜峰分離效果及峰型， 0.1%甲酸水-乙腈、0.1%乙酸水-乙腈體系得到的指紋圖譜整體峰形優于0.1%磷酸水-乙腈體系， 考慮到添加劑對質譜解析的影響， 最終選擇了 0.1%甲酸水-乙腈流動相體系。柱溫和體積流量是影響色譜行為的重要參數，骨通貼膏色譜圖中色譜峰較多，柱溫或體積流量的改變會影響色譜峰的保留值，進而影響分離效果。本實驗比較了 25 ℃、 30 ℃、 35 ℃柱溫下色譜圖，選擇分離效果最優的 25 ℃作為檢測柱溫， 當溫度升高時， 部分區域的色譜峰 （例如 22、 23 號峰）分離度下降，甚至重疊，說明本方法對溫度敏感，在試 驗 時 應 控 制 柱 溫 為 25 ℃。 對 0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min 體積流量下色譜圖進行比較， 選 取 分 離 效 果 及 色 譜 峰 型 較 好 的 1.0 mL/min為最佳體積流量，當體積流量升高時， 27、28、 29 號峰產生重疊， 體積流量降低時， 22、 23號峰分離度下降，說明本方法對體積流量敏感，在試驗時應控制體積流量為 1.0 mL/min。

3.3 骨通貼膏由丁公藤、麻黃、 當歸等十余種藥材提取制備而成，所含成分類型復雜，色譜響應行為千差萬別。因此，用于其綜合質量控制的指紋圖譜檢測波長的選擇就顯得尤為重要。 利用 HPLC/ DAD對骨通貼膏樣品進行紫外全波長掃描， 色譜峰整體在 190 ～350 nm波長范圍內吸收較強， 280 nm下色譜峰數最多， 且均有較好吸收， 可最大化地反應指紋圖譜有效信息， 故選擇 280 nm為骨通貼膏綜合質量控制的指紋圖譜檢測波長。皂苷及麻黃堿類成分僅在低波長有吸收，因此選擇 203 nm、280 nm兩個波長進行全方化學成分研究。

表2 骨通貼膏化學成分的鑒定Tab.2 Identification of com pounds in Gutong Plsater

3.4 在質譜分析中， 19 號與 23 號峰均得到 m/z 271 的分子離子峰， 與成分信息庫對比推測兩者為歐前胡素或異歐前胡素。 23號峰二級質譜信息得到 m/z203 的碎片峰， 根據文獻 ［14］， m/z 203［202+H］+是呋喃香豆素骨架與質子的耦合離子，為異歐前胡素特征碎片峰，且 19 號與 23 號峰的色譜行為符 合 文 獻［14-15］中 歐 前 胡 素與 異 歐 前胡 素 的色譜行為， 因此判斷 19 號峰為歐前胡素， 23 號峰為異歐前胡素。7號與8號峰的精確分子量與多級碎片信息相同，推測其為一對同分異構體，通過對照品比對， 確定 7 號峰為洋川芎內酯 I， 8 號峰為洋川芎內酯H。

3.5 本實驗建立的骨通貼膏指紋圖譜可較全面地反映骨通貼膏的內在質量，相似度分析可用于骨通貼膏的真偽鑒別及質量控制。 采用 HPLC-TOF/MS及 HPLC-ion-trap/MSn聯用技術對骨通貼膏中的化學成分進行了快速鑒別， 檢測鑒定了 21個分別源于丁公藤、麻黃、當歸、白芷、金不換、海風藤、三七、 干姜、 姜黃、 辣椒 10味藥材的特征成分，基本闡明了該復方制劑的化學組成，為多指標成分同時定量測定分析提供了理論依據，從而為骨通貼膏的全面質量控制奠定科學基礎。

［ 1 ］ WS3-120 （ Z-024） -2000 （ Z） -2010， 國 家 食 品 藥 品 監 督管理局國家藥品標準［S］.

［2］ 羅娟敏，肖 雪，梁瓊麟，等.丹紅注射液指紋圖譜研究［J］.中成藥， 2011， 33（8）： 1277-1280.

［ 3 ］ 羅國安， 梁瓊麟， 王義明.中藥指紋圖譜-質量控制與新藥研發 ［M］.北京： 化學工業出版社， 2009.

［ 4 ］ 王少敏， 胡 青， 季 申.GC/MS 法和 UPLC/Q-TOF-MS法研究丹香冠心注射液中的有效成分［J］.中成藥， 2012， 33（1）： 78-84.

［ 5 ］ 李蓓佳， 向 誠， 楊秀偉， 等.應用高效液相色譜-質譜聯用技術研究通脈顆粒的指紋圖譜［J］.藥學學報， 2010，45（11）： 1410-1414.

［6］ 曹 陽，梁瓊麟，章弘揚，等.中藥復方六神丸中多類成分的多維液質系統篩查和鑒定［ J］.分析化學， 2008， 36（1）： 39-46.

［ 7 ］ Zhang Hongyang， Hu Ping， Luo Guoan， et al.Screening and identification ofmulti-component in Qingkailing injection using combination of liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry and liquid chromatography/ion trap mass spectrometry［J］ .Analytica Chimica Acta， 2006， 577（2） ： 190-200.

［ 8 ］ 羅奇志， 羅佳波， 王有志.高效液相色譜-電噴霧串聯四級桿質譜定性分析雙黃連粉針中化學成分及其藥味歸屬［J］.藥學學報， 2009， 44（12）： 1391-1396.

［ 9 ］ 程紅艷， 陳軍輝， 楊黃浩， 等.高效液相色譜-電噴霧飛行時間質譜鑒別柄海鞘中的多種化合物及其特征圖譜［J］.藥學學報， 2010， 45（10）： 1285-1289.

［10］ 孫明謙， 盧建秋， 郜 欣， 等.延胡索甲素和延胡索乙素的電 噴 霧 質 譜 研 究 ［ J］.中 藥 材， 2008， 31 （11 ）：1671-1672.

［11］ 李松林， 林 鴿， 鐘凱聲， 等.應用 HPLC-DAD-MS 聯用技術研究中藥川芎指紋圖譜 ［ J］.藥學 學報， 2004， 39（8）： 621-626.

［12］ 楊 帆， 肖遠勝， 章飛芳， 等.當歸化學成分的 HPLCMS/MS 分析［ J］ .藥學學報， 2006， 41（11） ： 1078-1083.

［13］ 羅 藝， 白 鋼， 羅國安， 等.治咳川貝枇杷滴丸 UPLCQ-TOF-MS-E指紋圖譜研究［ J］ .藥物分析雜志， 2012， 32（11）： 1940-1944.

［14］ 蔡 敏， 周 燕， 喻世濤， 等.禹白芷中香豆素成分的HPLC-MS/MS 分 析 ［ J］.分析 測 試 學報， 2007， 26 （ 增刊）： 164-168.

［15］ 王婷婷， 陳曉輝， 胡慶慶， 等.白芷質量的 HPLC指紋圖譜評價方法［J］.藥學學報， 2006， 41（8）： 747-751.

HPLC fingerprint and chem ical constituents of Gutong Plaster

XIA Jing1， XIE Yuan-yuan2*， ZHANG Zong-xuan3， ZHANG Yan-hui4， WANG Yi-ming1，2，LIANG Qiong-lin2， LUO Guo-an1，2*
（1.JiangxiUniversity of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China； 2.Chemistry Department of Tsinghua University， Beijing 100084，China； 3.China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China； 4.Guilin Tianhe Pharmaceutical Co.， Ltd.Guilin 541001， China）

Gutong Plaster； fingerprint； HPLC； time-of-flightmass spectrometer； ion trap tandem mass spectrometer

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0571-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.027

2013-05-09

國家 “ 重大新藥創制” 科技重大專項 （2011ZX09201-201-07， 2011ZX09201-201-23）

夏 菁 （1987—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥質量控制。 Tel：（010） 62772265， E-mail： xiahuaz@126.com

*通信作者： 羅國安 （1946—） ， 男， 教授， 研究方向： 中藥質量控制。 Tel：（010） 62781688， E-mail： luoga@mail.tsinghua.edu.cn謝媛媛 （ 1980—）， 女 （ 滿 ） ， 博 士， 助 理 研 究 員， 研 究 方 向： 中 藥 質 量 控 制。 Tel： （ 010 ） 62794103， E-mail：yuanyuan8078@gmail.com

ABSTRACT： AIM To establish a fingerprintmethod for analyzing Gutong Plaster（ Erycibes Caulis， Ephedrae Herba， Angelicae sinensis Radix， Zingiberis Rhizoma， etc） by HPLC and a combinative LC/MS method for the identification ofmulti-components in Gutong Plaster.METHODS An HPLC in combination with PDA detector was applied on AlltimaTMC18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） column in gradientelutionmanner using acetonitrile-0.1%formic acid solution as themobile phase.The flow rate was1 mL/min and the detection wavelength was set at280 nm.A combination of time-of-flightmass spectrometer（ TOF-MS） and ion trap tandem mass spectrometer（Trap-MSn）was used for qualitative analysis under positive and negative ion modes.RESULTS HPLC fingerprintof Gutong Plaster was established choosing Z-Ligustilide peak as the reference peak and nineteen common peaks（21 chemical constituents） were obtained from standard fingerprint chromatograms of ten batches with similarity no lower than 0.990.CONCLUSION The HPLC method with good precision and reproducibility can be used for the quality control of Guton Plaster.