RP-HPLC法測定香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷

顧芹英， 李慧華， 秦 冬，2， 郭 敏， 楊 歡*， 賈曉斌，2*

（1.江蘇大學藥學院， 江蘇 鎮江 212013； 2.江蘇省中醫藥研究院， 國家中醫藥管理局中藥口服制劑釋藥系統重點研究室， 江蘇 南京 210028）

RP-HPLC法測定香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷

顧芹英1， 李慧華1， 秦 冬1，2， 郭 敏1， 楊 歡1*， 賈曉斌1，2*

（1.江蘇大學藥學院， 江蘇 鎮江 212013； 2.江蘇省中醫藥研究院， 國家中醫藥管理局中藥口服制劑釋藥系統重點研究室， 江蘇 南京 210028）

目的 建立測定中 藥 香 椿葉中槲 皮 素-3-O-α-L-鼠李糖 苷 的反相高 效 液相色譜 法。 方 法 采 用 Waters XBridge Shield RP18色譜 柱 （ 4.6 mm × 150 mm， 5 μm） ， 流 動 相 為 乙 腈 -0.1% 甲 酸 水 溶 液 （20 ∶80） ， 體 積 流 量 為 1.0 m L/m in， 檢測波長為 254 nm， 柱溫為 40 ℃。 結果 在以上色譜條件下， 供試品溶液中的槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷與干擾成分完全分離， 其在 5.260 ～105.2 mg/mL范圍內線性關系良好 （r2=0.999 1）， 重復性實驗 RSD=1.96% （n= 6）， 平均加樣回收率為 99.3% ～104.1% （n=3）， RSD為 4.23% ～4.78%。 結論 6 個產地香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的量分別為 0.826% ±0.025% （山西運城）、 0.271% ±0.006% （河南西平）、 0.459% ±0.016% （河南焦作）、 0.222% ±0.006% （四川簡陽）、 0.808% ±0.019% （山東西牟） 和 0.293% ±0.008% （江蘇鎮江）。

香椿； 香椿葉； 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷； 反相高效液相色譜法

中藥香椿葉 Toonae sinensis Folium為楝科 Meliaceae喬 木 香 椿 Toona sinensis Roem 的 干 燥 樹葉［1-2］， 味苦、 性溫， 無 毒， 有清熱收斂、 消 炎 解毒、去燥濕等功效，臨床上常用于治療腸炎、痢疾等疾?。?］。 由于其突出的療效以及世界范圍內對天然抗氧化劑的旺盛需求，近幾年里，對該中藥的抗氧化活性和相應有效化學成分的研究較為深入［4-9］。 活性篩選試驗發現， 從香椿葉中分 離得到的眾多多酚類化合物之中， 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷具有較 強 的 抗 氧 化 作 用［10-11］， 被 認 為 是香 椿 葉中的重要活性物質之一。

目前， LC-MS 已用于鑒別香椿葉中的沒食子酸及其衍生物等［2，12］。 然而， 對于槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷這一香椿葉中的重要活性物質，其定量分析方法以及不同產地藥材中該化合物的量比較至今尚未見任何報道。因此，本實驗建立了香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的反相高效液相色譜分析方法，并測定了6個產地香椿葉中該化合物，從而為香椿葉的質量評價提供參考。

1 儀器與材料

Waters XBridgeShield RP18色譜柱 （4.6 mm × 150 mm， 5 μm）； Mettler-Toledo AE240 電子分析天平 （0.01 mg）； 乙腈 （色譜純， Honeywell）， 甲酸（分析純， 國藥集團上海化學試劑有限公司）， 甲醇 （分析純， 成都科龍化工試劑廠）， 雙蒸水為實驗室自制； 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷為本實驗室分離得到， 并經1H-NMR和13C-NMR鑒定。

香椿葉分別采收自河南西平 （2012 年 7 月）、河南焦作 （2012 年 8 月）、 山西運城 （2011 年 8月）、 四川簡陽 （2012 年 6 月）、 山東西牟 （2011年7 月）和江蘇鎮江 （2013 年 7 月）， 并經江蘇大學生藥學研究所陳鈞教授鑒定為 T.sinensis的葉。鮮葉置通風處陰干， 粉碎后過 40 目篩， 收集細粉供分析用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters XBridge Shield RP18色譜柱（150 mm ×4.6 mm， 5 μm）； 流動相為乙腈 -0.1%甲酸水溶液 （20 ∶80）； 體積流量 1.0 mL/min； 檢測波長 254 nm； 柱溫 40 ℃； 進樣量 20 μL。

2.2 對照品貯備液的制備 精密稱取槲皮素貯備液-3-O-α-L-鼠李糖苷對照品 10.52 mg， 加 60%甲醇溶解并定容至 50 m L， 配制成質量濃度為 210.4 μg/mL的對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備 取香椿葉細粉 0.100 g，精密稱定， 置 50 m L具塞離心管中， 精密加入60%甲醇 25 m L， 稱重， 超聲提取 15 min， 冷卻至室溫， 加 60%甲醇補足失質量， 取上清液， 0.20 μm微孔濾膜濾過， 棄去初濾液5 mL， 取續濾液作為供試品溶液，待測。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取 “2.2” 項下對照品貯備液 5、4、 3、 2、 1 mL， 移入 10 mL量瓶中， 加入 60%甲醇稀釋至刻度， 搖勻，得質量濃 度 為 105.2、 84.16、 63.12、 42.08、 21.04 μg/mL對照品溶液； 再將 21.04 μg/m L對照品溶液進行兩次二倍稀釋， 分別得到質量濃度為 10.52 μg/mL和 5.260 μg/mL的對照品溶液； 以上 7 份溶液按照 “2.1” 項色譜分析條件進樣測定。 以峰面積 （Y） 為縱坐標， 質量濃度 （X， μg/mL） 為橫坐標進行線性回歸，計算得回歸方程為 Y= 42 087.120 7X-4 170.292 5， r2=0.999 1。

2.5 精密度考察 分別吸取低、 中、 高 3 個質量濃度的對照品溶液和供試品溶液 （江蘇鎮江樣品）， 按照 “2.1”項下方法測定峰面積，每個質量濃度重復進樣 6 次，計算得槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖 苷 的 峰 面 積 RSD 分 別 為 1.41%、 1.95%、1.87%和 0.90%， 表明儀器的進樣精密度良好。

2.6 穩定性考察 吸取同一份供試品溶液 （江蘇鎮江樣品，室溫下保存）， 分別于 0、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 36、 48 h， 按照 “2.1” 項下方法測定，計算得該化合物峰面積的 RSD為 1.53%， 表明在48 h內供試品溶液的性質穩定。

2.7 重復性試驗 按照 “2.3” 項下方法制得供試品溶液 6 份 （江蘇鎮江樣品）， 按照 “2.1” 項下方法測定，計算該化合物在藥材中含有量的RSD為 1.96%， 表明該方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已測定含有量的藥材粉末 9 份 （江蘇鎮江樣品）， 每份 50.0 mg， 精密稱定，精密加入一定量的對照品溶液 （高、中、低3種加入量， 各重復 3 次）， 用 60% 甲醇補足至25 mL， 其余按照 “2.3” 項下方法制得供試溶液共 9 份， 并按照 “2.1” 項下測定， 計算加樣回收率， 和 RSD， 結果如表1 所示。

表1 加樣回收率實驗結果Tab.1 Results of recovery tests

2.9 樣品測定 按照 “2.3” 項下方法制得 6 批藥材供試品溶液各 3 份， 按照 “2.1” 項下方法測定峰面積，代入回歸方程，并計算所測成分在藥材中的百分含有量。 結果顯示， 香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的含有量分別為 0.826% ±0.025% （山西運城）、0.271% ±0.006% （河南西平）、 0.459% ±0.016%（河 南 焦 作）、 0.222% ±0.006% （ 四 川 簡 陽）、0.808% ±0.019% （山東西牟） 和 0.293% ±0.008%（江蘇鎮江）。 色譜圖見圖1、 圖2。

圖1 對照品溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the reference solution

圖2 6個產地香椿葉的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of samples from six habitats

3 結論與討論

3.1 實驗中比較了 4 根色譜柱， 即 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8（ 4.6 mm × 150 mm， 5 μm） 、Thermo ODSHypersil（4.6mm ×150mm， 5 μm） 、Merck Chromolith Performance RP-18e（4.6 mm × 100 mm， 5 μm） 、 Waters XBridge Shield RP18（4.6 mm × 150 mm， 5 μm） ， 最 終 發 現 使 用 Waters XBridgeShield RP18（4.6 mm × 150 mm， 5 μm）時，出峰時間適中，峰對稱性好，并且可與其他峰達到基線分離，最終為本實驗采用。

3.2 實驗中比較了不同體積分數甲醇 （20%、40%、 60%、 80%和 100%） 為溶劑以及不同超聲時長 （15 min、 30 min、 45 min 和 60 min） 的 提 取效果， 發現以 60%甲 醇 超 聲 提 取 香 椿 葉粉末 15 min， 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的色譜峰面積最大。3.3 對從不同產地采收得到的香椿葉樣品進行測定的結果表明，山東西牟、山西運城和河南焦作產香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的量明顯高于江蘇鎮江、河南西平、四川簡陽三個產地，而山東、山西和河南是香 椿 的 道 地 產 區［13］， 可 見 該 化 合 物的量與香椿藥材的道地性呈現正相關。

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Determ ination of quercetin-3-O-α-L-rhamnoside in Toonae sinensis Folium by RP-HPLC

GU Qin-ying1， LIHui-hua1， QIN Dong1，2， GUO Min1， YANG Huan1*， JIA Xiao-bin1，2*

（1.School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China； 2.Key Lab of ChineseMedicine Delivery System of SATCM， Jiangsu Provincial Academy of ChineseMedicine， Nanjing 210028， China）

Toona sinensis； Toonae sinensis Folium； quercetin-3-O-α-L-rhamnoside； RP-HPLC

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0577-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.028

2013-08-06

江蘇省自然科學基金 （BK2012290）； 常州市科技支撐計劃 （CE20125042）； 江蘇大學高級人才科研啟動基金 （11JDG073）；江蘇大學學生科研立項項目 （12A491）

顧芹英 （1990—）， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥學。

*通信作者：楊 歡，男，副教授。賈曉斌， 男， 教授， 研究方向： 中藥物質基礎。 Tel：（025）85608672， E-mail： jxiaobin2005@hotmail.com