三叉苦中6種成分比較研究

楊樹娟， 余 玲， 康國嬌， 周海瑜， 楊增明，2*

（1.云南良方傣藥研發技術中心， 云南 昆明 650217； 2.昆明貝葉傣醫藥研究所， 云南 昆明 650217）

［飲片炮制］

三叉苦中6種成分比較研究

楊樹娟1， 余 玲1， 康國嬌1， 周海瑜1， 楊增明1，2*

（1.云南良方傣藥研發技術中心， 云南 昆明 650217； 2.昆明貝葉傣醫藥研究所， 云南 昆明 650217）

目的 比較6種成分在中國南方不同產地、不同季節、不同部位三叉苦樣品中的分布情況。方法 樣品用甲醇回流提取， 采用 HPLC法測定， 以乙腈 -0.1%磷酸溶液為流動相， 梯度洗脫， 檢測波長為 246、 330、 285 nm。 結果6 種成分分離度良好， 檢測限低， 在線性范圍內各成分均呈良好的線性關系， r＞0.999 7， 平均回收率為 97.84%～100.61%， RSD為1.12% ～3.89%。 結論 來自9 個產地的32 個不同季節、 不同部位樣品中， 6 種成分的含有量差異很大， 相對而言吳茱萸春的分布最廣， 在云南景谷和金平產三叉苦中含有量較高， 特別是葉， 其他依次為 7-去甲基軟木花椒素和 3-異戊烯基傘形花內酯， 3，7-二甲氧基山柰酚和 3，7，3'-三甲氧基槲皮素， 芝麻素僅分布在云南西雙版納產三叉苦葉中。

傣藥； 三叉苦； 芝麻素； 7-去甲基軟木花椒素； 3-異戊烯基傘形花內酯； 吳茱萸春

目前，已有一些關于三叉苦不同產地、不同部位化學 成 分 比 較 的 研 究 報 道［3-5］。 但 是， 不 同 產地、不同部位三叉苦化學成分差異及其與臨床應用的關系，尚需深入研究。同時，為尋找專屬性強、與功能主治緊密相關的成分，用于藥材和制劑的質量控制，本實驗選擇1個生物堿類成分吳茱萸春（1）、2 個香豆素類成分 7-去甲基軟木花椒素 （2）和 3-異戊烯基傘形花內酯 （3）、 2 個黃酮類成分3，7-二甲氧基山柰酚 （4） 和 3，7，3'-三甲氧基槲皮素 （5）、 1 個木脂素類成分芝麻素 （6）， 作為代表性成分， 采用 HPLC法， 對 6 種成分在不同產地、不同季節和不同部位三叉苦中的分布進行了全面的定量比較研究，為三叉苦有效部位、有效成分研究和藥材標準研究及其進一步研究與開發等工作奠定基礎。

1 儀器與材料

Waters Acquity-UPLC （ H-Class） 高 效 液 相 色譜儀， PDA Detector， Empower Chemstation； MS105電子天平 （梅特勒-托利多）。 6 種對照品均為自制， 經 MS、1H-NMR、13C-NMR等確定結構， HPLC檢查面積歸一化法計算純度均在 97%以上。 乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

在 9 個不同產地采集了 11 個樣品 （S1 ～S11）， 共分作 32 個研究用樣品，產地、部位和采樣日期 （批號的6位數字依次為采樣年份、 月份、日期） 見表3， 所有樣品均經昆明植物研究所雷立功研究員鑒定為 Evodia lepta （Spreng.） Merr.。憑證標本 （標本號 1201） 存放于昆明貝葉傣醫藥研究所。將采集的三叉苦樣品各部位分開，葉陰干，其余切段或片，曬干，粉碎成粗粉，備用。

2 方法

2.1 色 譜 條 件 Agilent ZORBAX SB-C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相為乙腈 -0.1%磷酸溶液， 梯度洗脫 （0 ～25 min， 35%乙腈； 25 ～27 min， 35% ～42% 乙 腈； 27 ～60 min，42%乙腈）； 吳茱萸春的檢測波長為 246 nm， 芝麻素為 285 nm， 其余均為 330 nm， 同時開啟 190 ～400 nm紫外光譜檢測； 體積流量 1 mL/min， 柱溫30 ℃， 進樣量 10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別取吳茱萸春、 7-去甲基軟木花椒素、 3-異戊烯基傘形花內酯、 3，7-二甲氧基山柰酚、 3，7，3'-三甲氧基槲皮素、 芝麻素 6種對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成單個對照品溶 液 母 液， 質 量 濃 度 依 次 為 1.008、2.562、2.520、 1.015、 1.029、 5.000 mg/mL， 分 別 精 密量取1mL， 混合， 稀釋至10mL， 即得混合對照品溶液母液。

2.3 供試品溶液的制備 取樣品粗粉約2 g， 精密稱定， 置 250 mL具塞錐形瓶中， 精密加入甲醇100 mL， 稱定質量， 回流提取60 min， 放冷， 再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液 75 mL， 減壓濃縮至近干， 加甲醇使溶解并稀釋至適宜濃度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 線性關系、 檢測限和定量限考察 取混合對照品溶液母液， 分別稀釋 0、 10、 100、 300 倍， 在10、 6、 5、 3、2 μL間， 分別精密吸取適量進樣檢測，繪制標準曲線，得回歸方程和相關系數。以信噪比 s/n 約為 10 時的進樣量為定量限，s/n 約為 3時為檢測限，結果見表1。

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表1 對照品的線性關系和線性范圍Tab.1 Linear relationship and linear range of references

2.5 精密度試驗 取 “2.4” 項下稀釋 10 倍的混合對照品溶液， 按 “2.1” 項下的色譜條件， 連續進樣6 次， 結果 6 種化合物的峰面積的 RSD依次為 1.10%、 0.58%、 0.61%、 0.93%、 1.13%、1.54%， 表明儀器和方法的精密度良好。

2.6 重復性試驗 取混勻的樣品 S5-3 粗粉 6 份，按 “2.3”項下的方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件檢測。 結果 6 種化合物的峰 面 積 的 RSD 依 次 為 2.1%、 2.7%、 2.6%、1.9%、 1.7%、 2.4%， 表明該方法的重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取 “2.6” 項下的同一供試品溶液， 分別于 0、 4、 8、 20、 24 h 時， 按 “2.1”項下的色譜條件檢測。結果6種化合物的峰面積的RSD 依 次 為 1.5%、 1.7%、1.9%、2.0%、2.1%、 2.2%， 表明供試品溶液在 24 h 內穩定。

2.8 準確度試驗 取混勻的樣品 S5-3 粗粉 6 份，每份約 1.0 g， 精密稱定。 再分別取 “2.2” 項下單個對照品溶液母液適量， 分別稀釋 100 倍， 分別精密量取 10、5、 2、3、 5、 15 mL各 6 份， 加入 6份樣品中，加甲醇 60 mL， 分別按 “2.3”、 “2.1”項下的方法依法檢測， 計算， 結果見表2。

表 2 各成分的加樣回收率 （n=6）Tab.2 Determ ination results of recovery tests（ n=6）

2.9 樣品測定 取不同產地、 不同季節、 不同部位三叉苦樣品粗粉各約 2 g， 照 “2.3”、 “2.1”項下的方法，依法檢測，保留時間一致并紫外吸收光譜一致即認定為同一化合物，計算。色譜圖見圖1， 結果見表 3。

3 分析

3.1 不同產地 芝麻素是云南西雙版納產三叉苦葉的特征性成分，在其他產地、其他部位中均未檢出該化合物；云南景谷和金平產三叉苦中吳茱萸春的量較高， 特別是葉， 高達 1.8% ～3.2%， 而其他產地的葉中均未檢出吳茱萸春。

總體上看， 吳茱萸春、 7-去甲基軟木花椒素和3-異戊烯基傘形花內酯是 9 個產地三叉苦根和莖的共有成分。景谷的兩個樣品是不同月份采收的同一植株的不同的兩枝，如果作為一個樣品計的話，吳茱萸春在除 S11-3 外的所有 14 個根和莖樣品中均有檢出； 7-去甲基軟木花椒素和 3-異戊烯基傘形花內酯都分別在12個樣品中檢出， 它們僅僅是異戊二烯基在香豆素母核上的位置不同，如果合并計的話，它們也在除 S8-3 外的所有 14 個樣品中均有檢出。

圖1 對照品和樣品 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

3.2 不同季節 如前所述， S6 和 S7 是標準的兩個不同季節樣品， S6-3 與 S7-3 中 7-去甲基軟木花椒素和 3-異戊烯基傘形花內酯的含有量存在非常大的差異，但 S6-5 與 S7-5 則基本一致。 S4 與 S5，二者并不在同一地點采集，各成分含有量存在一定差異。

表 3 32 個三叉苦樣品中 6 種化合物測定結果 （ μg·g-1）Tab.3 Determ ination results of 32 sam p les（ μg·g-1）

3.3 不同部位 相對而言， 吳茱萸春是各部位的共有成分，在葉和/或根中的含有量高于莖，但在多個葉樣品中未檢出；7-去甲基軟木花椒素、3-異戊烯基傘形花內酯、 3，7-二甲氧基山柰酚、 3，7，3'-三甲氧基槲皮素主要存在于莖和根中，均未在葉中檢出；芝麻素則未在根、莖中檢出。根的成分與莖基本一致而含有量稍高，莖皮的兩個黃酮類成分稍高，嫩枝的成分和含有量則介于葉和莖之間。

4 討論

本研究建立了 HPLC同時測定三叉苦中 6 種成分含有量的方法，操作簡便，重復性、回收率等較好， 結果準確可靠。采用該方法對 9個產地的 11份采集樣共32個樣品進行了測定。

4.1 關于樣品的產地和季節 西雙版納的 4 個產地是位于景洪西南約50 km內的 4 個地點， 采集點海拔 670 ～1100 m。 景谷和金平采集點海拔1100 ～1200 m， 位于景洪北部和東部， 西雙版納采集點至景谷直線距離約 160 km，中間有瀾滄江相隔， 但無大型山脈相隔； 至金平約 260 km， 有瀾滄江和無量山余脈相隔。廣東鼎湖山與陽春直線距離約150 km。

從經緯度分析， 云南 6 個產地分布在 N 21°～23°和 E 100°～103°間， 全部 9 個產地分布在 N 21°～23°和 E 100°～112°間， 根據文獻［6］， 臺灣、海南和西藏墨脫除外，中國三叉苦分布范圍在N 21°～25°和 E 99°～117°間。

本研究 11 份采集樣品的采收季節分布在 11 月份和3～7月份。

4.2 測定部位和測定成分的選擇 目前， 三叉苦商品藥材以莖和/或葉為主，嫩枝也是某些藥材標準規定的藥用部位，民間還有以根、樹皮藥用的記載［2，7-8］， 據此， 本實驗把 三 叉 苦分解為 根、 樹皮、莖、嫩枝和葉等5個部位進行比較測定，其中又以莖和葉為主。

三叉苦主要含有生物堿、色烯、香豆素和黃酮等多類具 有 鮮 明結 構 特 點的 化 合 物［5，8-9］， 本 實 驗選擇1個喹啉類生物堿，2個具異戊二烯結構的香豆素，2個具有多甲氧基的黃酮苷元，以及1個木脂素，進行定量比較研究，具有很好的代表性。6種成分都具有顯著的藥理活性［9-15］， 因此研究 結果同時具有較強的實際意義。

4.3 色譜條件的確定 比較了甲醇-水、 乙腈-水、乙腈 -0.1%磷酸、 乙腈 -0.1%三氟乙酸、 乙腈 -0.4%冰乙酸等作為流動相， 在不同梯度洗脫條件下的色譜效果，以方法項下的條件色譜效果最好，且能同時測定 6 種成分。6 種成分分別在 246.5（ 321 ）、 332 （ 220 ）、 324、 350 （ 267 ）、 355（253）、 286 （236） nm處有最大吸收峰， 根據各化合物在相應波長下的吸收系數及其含有量高低，以及相應波長下的基線情況和雜質干擾情況，綜合研判，選擇方法項下的檢測波長。

4.4 供試品溶液的制備 分別以不同倍數的甲醇、乙醇、 60%乙醇作為溶劑， 以超聲、熱回流的方式進行提取，結果以 50 倍量甲醇回流提取的提取率最高、基線最好、最省時省力。樣品中各成分的含有量差異較大，經研究確定了最佳取樣量，但必要時還需根據測定結果，適當稀釋后重復測定，以使各成分均在線性范圍內。

4.5 測定結果綜合分析 如果不分部位而以全株計， 吳茱萸春分布于全部9 個產地的所有 11個三叉苦采集樣中， 7-去甲基軟木花椒素和 3-異戊烯基傘形花內酯分布范圍次之， 3，7-二甲氧基山柰酚和3，7，3'-三甲氧基槲皮素再次之， 芝麻素僅分布于西雙版納產三叉苦中。

把9個產地分成3個區域，一為云南西雙版納州， 包括 S1 ～S5， 它們的根和莖中均含有除芝麻素以外的5種化合物，且根中的含有量均明顯高于莖，為傣醫應用根提供了一定的依據，最顯著的特征是它們的葉中均含有化合物芝麻素，這很可能成為它們的鑒別指標；二為云南景谷縣和金平縣，包括 S6 ～S8， 它們的各部位中均未檢出 3，7-二甲氧基山柰酚、3，7，3'-三甲氧基槲皮素和芝麻素，7-去甲基軟木花椒素和 3-異戊烯基傘形花內酯也僅在部分樣品、部分部位中檢出，但不僅全部9個樣品中均檢出吳茱萸春，而且其含有量較高，特別是葉中的含有量高達 1.8% ～3.2%， 這同樣很可能成為它們的鑒別指標；三為廣西 （梧州市）和廣東（鼎湖山及陽春市）， 包括 S9 ～S11，它們的葉中均未檢出 6 種化合物，S9-3 和 S10-3 均含有除芝麻素以外的 5 種化合物， S11-3 和-4 中只檢出 3-異戊烯基傘形花內酯， S11-1 中檢出吳茱萸春和 3-異戊烯基傘形花內酯。

總之，本研究結果表明，不同產地三叉苦的相同部位間，同一產地三叉苦的不同部位間，以及同一產地但不同季節三叉苦的同一部位間，6種化學成分各自的含有量均存在較大差異，但亦有一定的特點和規律。不同產地三叉苦間成分的巨大差異，與其原植物在形態上的地理變異并成為一個多型種［1］有著必然的聯系。

綜上，為闡明三叉苦藥用物質基礎，有效控制相關成方制劑及其原料三叉苦藥材的質量，有必要在更大的經緯度范圍內，更大的時間 （季節）范圍內采集更多樣品，在同一居群、同一植株內采集多個同一季節及不同季節的樣品，進行更多樣品、更多成分的定量比較研究，可能還需借助 DNA鑒定等多種技術手段開展研究。同時，需加強樣品的鑒定工作，樣品應鑒定至原變種和變種，并關注原植物性狀的差異，以利于結果的綜合分析。

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Distribution comparison of six constituents from Evodia lepta

YANG Shu-juan1， YU Ling1， KANG Guo-jiao1， ZHOU Hai-yu1， YANG Zeng-ming1，2*
（1.Liangfang Research and Development Center of Pattra Medicine of Yunnan， Kunming 650217， China； 2.Kunming Institute of Pattra Medicine，Kunming 650217， China）

AIM To compare six constituents in Evodia lepta from different habitats， different harverst time and different parts in south China.METHODS HPLCmethod for six constituents was established with amobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution in gradient elution manner.The detection wavelength were set up at246， 330， 285 nm.RESULTS The six constituents were well separated ， and showed a good linearity， r=0.999 7-0.999 8.The average recovery was in the ranges of 97.84%-100.61%， RSD 1.12%-3.89%.CONCLUSION The content of all the six constituents showed significant difference in the 32 samples of Evodia lepta from nine habitats.Among these six constituents， evolitrine is themostwidely distributed，relatively high in particular in the leaves from Jinggu and Jinping districts.，7-demethylsuberosin and 3-（3-methyl-but-2-enyl） umbelliferone in turn， kamatakenin and pachypodol the third.Sesamin is only detected in the leaves of Evodia lepta from Xishuangbanna.

Pattra medicine； Evodia lepta； sesamin； 7-demethylsuberosin；3-（3-methyl-but-2-enyl） umbelliferone； evolitrine

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0580-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.029

2013-09-26

“十二五” 國家科技支撐計劃 （2012BAI27B06-1） ， 云南省科技計劃 （2013AE001）

楊樹娟 （1983—）， 女， 工程師， 研究方向： 中藥及民族藥。

*通信作者： 楊增明 （1965—） ， 男， 正高級工程師。 E-mail： bydyy@188.com