二維薄層色譜技術的研究進展

方 琳， 姚 帥， 崔亞君*， 吳婉瑩

（1.上海中醫藥大學， 上海 201203， 2.中國科學院上海藥物研究所， 上海 201203）

［綜 述］

二維薄層色譜技術的研究進展

方 琳1， 姚 帥2， 崔亞君1*， 吳婉瑩2

（1.上海中醫藥大學， 上海 201203， 2.中國科學院上海藥物研究所， 上海 201203）

二維薄層色譜是一種新型的薄層色譜技術，主要包括單固定相二維薄層色譜、雙固定相二維薄層色譜和二維移植薄層色譜。本文通過查閱國內外文獻，對不同二維薄層色譜技術的操作方法及特點、二維薄層色譜圖像處理、與其他技術聯用的進展進行了介紹，并對其未來發展提出了展望。二維薄層在保留了一維色譜的所有優點的基礎上，大大擴充了峰容量，提高了分離效果，可為中藥質量控制的發展研究提供新的思路。

二維薄層色譜；中藥；單固定相二維薄層色譜；雙固定相二維薄層色譜；二維移植薄層色譜

薄 層 色譜法 （ thin layer chromatography， TLC） 是 被 廣泛應用于各個領域的一種常用技術，在監測中藥分離純化，中藥材、制劑的定性鑒別和質量控制等方面一直發揮著不可替代的作用。中藥具有成分復雜多樣的特點，有些藥材種屬來源眾多，因此在中藥材的采收、加工、流通等過程中容易出現偽劣摻假等行為。中藥現代化主要是以現代化各種分離技術反映中藥整體輪廓特征。但普通薄層色譜的峰容量十分有限，在中藥等成分復雜樣品的分析過程中顯得力不從心， 于是， 一種更為先進的薄層色譜技術——二維薄層 色譜 （ two-dimensional thin-layer chromatography， 2DTLC） 應運而生。

二維薄層色譜應當滿足兩個條件：兩個維度的分離機制是相互正交的；在第一維中已被分離開的兩個物質在第二維展開的過程中依然是分離的［1］。 其在擴充峰容量提高分離效果的基礎上，幾乎保留了一維色譜的所有優點：采用一次性固定相，樣品通常無需凈化精制，節約分析成本和時間；結果可視化；所需展開劑量少，節約試劑；固定相和流動相選擇范圍廣；所有斑點貯存在薄層板上，可隨時對其重復掃描檢測， 得出最佳結果［2］。 1994 年至今共有26 篇相關研究論文發表 （見表 1）， 本文據此對二維薄層色譜進行綜述。

表1 二維色譜相關研究論文發表趨勢

1 二維薄層色譜分類

根據近年來國內 （見表 2） 和國外 （見表 3） 的實驗研究，較為常用的二維色譜大致有3種，單固定相二維色譜、雙固定相二維色譜以及二維移植色譜。

1.1 單固定相二維薄層色譜 單固定相二維薄層色譜（2D-TLC on one absorbent）， 即薄層板只有一種固定相涂層。樣品在薄層板的一角點狀點樣，在第一個方向上展開，晾干之后， 旋轉 90°， 在第二個方向上再次展開［3］。

為達到較好的分離效果，一般可選擇中等極性的固定相，并在兩個方向上使用不同的溶劑系統，使兩個維度分別為正相展開系統和反相展開系統。當然，理論上也可以在兩個維度上都使用相同的展開系統，但這樣只是相當于延長了展距，對分離效果并無明顯的提升，因此較少被采用。

這里存在著一個問題，由于兩次展開都在同一塊薄層板上進行，因此第一維所使用的展開劑很可能會對固定相的性質造成一定的影響，為了避免這種情況的發生，在兩次展開之間的流動相去除步驟十分關鍵。倘若第一維展開劑中含水，則干燥過程將十分耗時，且很難控制薄層板的含水量，故建議將含水展開劑放在第二維，以確保方法的重現性。

1.2 雙固定相二維薄層色譜 雙固定相二維薄層色譜（2D-TLC on bilayer plates）， 即薄層板鋪有兩種不同的固定相涂層，一種涂層為一窄條帶，薄層板的剩余空間鋪滿另一種涂層。樣品在條帶涂層的一端點狀點樣，在第一個方向上展開， 晾干之后， 旋轉 90°， 在第二種涂層上進行展開［4］。 第一維固定相還能起到預濃縮的作用， 使第二維展開的條帶更細，展開結果更為美觀。

雙固定相二維色譜也和單固定相二維色譜存在著相同的問題，即兩次展開過程之間的干燥問題，但其問題更為嚴峻，單固定相二維色譜尚可選擇將反相系統在第二維展開，但雙固定相二維色譜的兩個維度已被預制，第一維若為十二烷基硅膠之類的固定相，則只能選擇將反相展開系統作為第一維，無法回避控制含水量的問題。

表2 二維薄層色譜技術國內進展

表3 二維薄層色譜技術國外進展

1.3 二維移植薄層色譜 二維移植薄 層色譜 （ graft-TLC）與雙固定相二維色譜有些許相似，也是在第一維的固定相展開之后， 旋轉 90°， 將樣品在另一種固定相上進行展開，但不同之處在于兩種固定相是相互獨立的，樣品從第一相到第二相的轉移是通過將兩塊薄層板面對面放置，部分重合后用夾子固定住，利用洗脫能力較強的展開劑將樣品從第一維固定相中推至第二維固定相中［4］。

二維移植色譜可實現多個樣品同時展開，只需在第一維展開時將樣品并列點在同一塊薄層板上，展開過程結束之后沿著展開方向將薄層板裁成狹窄條帶，下一步分別轉移至各自的相同或不同的第二維固定相進行展開即可。

二維移植色譜與前兩種二維色譜相比，有更為廣泛的固定相類型可供選擇，可在不同的分離維度上選擇不同的固定相進行組合，取得更為理想的分離效果。

1.4 其他二維薄層 除了上述 3 種方法， 還有一些未被廣泛應用的二維薄層技術。

在第一維展開結束之后，有時很難找到一種合適的展開劑在第二維對所有的物質都能好的分離效果，有人提出了一種在單固定相二維薄層的基礎上進行改進的展開方式，在第一維結束之后，將薄層上的樣品延著第二維的方向劃成幾個組分，通過每次保留特定組分的底部固定相而劃除其他組分的底部固定相，以保證每次只有一個組分被其專屬展開劑所展開，達到每個組分獨立展開的目的，其分離效果較單固定相二維薄層有了很大的提高［5］。 這種方法雖然是一種新穎有趣的二維薄層技術，但其操作過程較為繁瑣，在固定相的劃除過程中，不同人之間操作的偏差較大，對其展開結果影響較大。

另有一種二維薄層，將兩塊涂層不同的條狀薄層板面對面放置，部分重合后用夾子固定住，樣品在第一維展開結束之后直接進入第二維展開［6］。 這種薄層展開方式雖然在分離方向上不垂直，但其分離機制正交，也可以被納入二維色譜的范疇，且這種展開方式效果優于單固定相二維薄層。

2 圖像處理技術

采用薄層色譜法分析樣品后，獲得的輪廓圖可以通過攝像以圖片的形式保存。傳統的方式是一般通過保存的圖像得到直觀的視覺感官信息，尋找待測樣品的特征斑點，并對不同來源的樣品進行辨別，此外，也可以通過其他方式來獲得更為豐富的數據信息。

一種方法是通過向專業軟件導入薄層照片得到相應的色譜峰信息。在導入之前，應對圖像進行適當的預處理，減少由于拍攝過程中光線等影響造成的圖像失真等情況。二維薄層的圖像預處理與一維色譜相似，也可通過灰度變換、去噪、平滑、銳化等預處理方式達到圖像復原、增強等目的，以便于在下一步的分析如聚類分析中取得更為客觀的結果［23，28-29］。 薄層色譜 在很多時候被認為 是一種定性或半定量技術，其實，如果能夠經過適當的圖像處理，尤其是扣除背景，定義斑點邊緣之后，其不失為一種很好的定量技術［30］。

此外，運用薄層掃描儀可在紫外光或可見光下得到薄層圖譜中特征斑點的類似液相的保留時間與峰面積的對應信息。目前的二維薄層掃描使用的是與一維薄層相同的掃描儀， 在一個薄層平面上最多只能呈現 36 條掃描通路［20-21，26-27］， 這對峰容 量 較大， 樣品斑 點 分 布 較 為 集 中 的二維色譜來說還不夠，需要有更為先進的掃描儀器提供相同面積下更為豐富的掃描通路來展現二維薄層色譜最佳的視覺效果。

對于二維薄層圖像處理， Matlab 和 Image J是目前應用最為廣泛 的 軟件。 ?ukasz Komsta［23］等人通 過 Image J對 單固定相二維薄層的結果圖像進行了一系列的處理，成功地使斑點得到了客觀準確的聚類分析結果。

3 與其他技術聯用

通過薄層色譜得到的樣品整體數據輪廓，可以對不同種屬植物來源藥材或相近品種進行鑒別，但要說清楚其不同的特征成分，需要對樣品的特征斑點的化合物或一類化合物進行成分識別，除了傳統的離線方式將斑點成分逐一提取出來，然而近年來，薄層色譜質譜聯用技術嘗試了一種在線的成分識別方法。其中，應用最多的是電噴霧解吸電離技術：電噴霧的發射器在距離薄層板2 mm左右的高度并呈一定的角度將帶電離子打到薄層板上，待測樣品從固定相表面解吸出來并被電離，從而進入質量分析器獲得質譜圖［22，31］。 現有的薄層 質 譜 聯 用 技 術 尚 存 在 一 些 不 足，如待分析斑點濃度較低，不足以獲得特征分子量及碎片離子，質譜從薄層板上直接收集待測斑點的空間分辨率較低。

還可以和其他色譜技術如氣相色譜 （GC）、 超臨界流體色譜 （SFC）、 高效液相色譜等進行聯用， 但要實現與這些色譜的聯用，需要解決如何將第一維所得化合物組分引到薄層板上的問題。

目前二維薄層色譜與其他技術的聯用對儀器設備的要求較高，現有的方法并非所有的實驗室都能夠實現，隨著二維薄層被更多的研究者所認識和重視，我們期待更多它與其他技術的聯用方式的出現。

4 二維薄層色譜展望

我國學者早在上個世紀90年代就已開始進行二維薄層色譜的相關研究 （見表 2）， 多集中于單固定相二維薄層，將其應用于單味中藥及中藥復方成藥的研究。雖然在研究過程中取得了較好的分離效果，但展開方式較為單一，且由于當時儀器設備相對簡陋，對結果的處理方式還停留在一維薄層色譜水平階段，并未建立與二維薄層色譜技術相適應的圖像分析和數據處理方法，更沒有系統的成分識別方法，對其的應用也僅僅局限在作為一種化合物分離技術，并未挖掘出其在中藥質量控制方面存在的巨大潛能，和在其他方面的應用價值，因此并未在國內研究者中得到足夠的重視，這些可能是今年來國內二維薄層色譜研究工作相對停滯的原因。

而國外學者對二維薄層色譜的研究則顯得更加豐富化（見表3）， 開發出各種展開方式， 形成多種圖像處理方法，將其廣泛地應用于生物化學、生物學、天然藥物的分離分析，并且仍在不斷地進行新的嘗試和探索。

二維薄層色譜的峰容量理論上可達 100 到 250［1］， 但國內外的二維薄層色譜研究中均未實現過如此高的峰容量，表明二維色譜薄層的理論和技術還有很多值得探索之處。

由于供試品和對照品不能在同一塊薄層板上進行展開，因此斑點的指認有一定的難度，需要每次展開具有較高的重復性，但目前的二維薄層色譜在兩個維度之間進行轉換的步驟尚需人力操作，重復性難免不高，故開發合適的色譜專用展開裝置甚至自動裝置十分有必要。已有人嘗試對二維展開裝置進行了相關研究［32］， 但目前市場上還并未發現有相關產品，其仍有較大的開發潛力。

作為復雜體系，即使單味中藥，其化學組分也極其龐大， 常多于 100 種， 對其進行質量控制研究是目前中藥研究的熱點和難點。目前已有的質控方法多針對于少數幾個特征成分，難以滿足近年我國藥典修訂大綱提出的整體質量控制的要求，而二維薄層色譜不僅僅是一種優秀的分離技術，其極高的峰容量是一維薄層和一維液相所無法媲美的，且其結果重現性也較高，在中藥復雜成分質控研究中擁有極大的發展空間。值得引起注意的是，美國藥典已經在食品補充劑一冊中的西洋參等中藥的監測方法中應用了單固定相二維薄層，使二維薄層色譜的質控能力得到了很好的證明。美國藥典注重以更加先進的方法更加全面地對可監測到的所有成分即整體輪廓進行質量控制，并以實際行動邁出了這一步，我們有理由相信，在不久的將來，這也會成為我國中藥復雜體系整體輪廓質量控制的發展方向。

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R284.1

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10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.031

2013-07-08

方 琳 （1989—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥學。 Tel： 13818459120， E-mail： fanglincorn@126.com

*通信作者：崔亞君，女，副教授，研究方向：中藥質量標準。