濃香型白酒窖泥厭氧細菌的分離鑒定

王贊，李光輝，羅惠波

（四川理工學院釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000）

濃香型白酒窖泥厭氧細菌的分離鑒定

王贊，李光輝，羅惠波

（四川理工學院釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000）

濃香型白酒的生產(chǎn)依賴于窖池，窖池的好壞取決于窖泥微生物，其中厭氧微生物尤為重要。為了認識窖泥厭氧微生物，從濃香型白酒窖泥中分離純化得到3株厭氧細菌，對其進行菌落觀察、鏡檢和生理生化檢測，參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行初步鑒定并確定其屬名。3株厭氧細菌分別為:Lactobacillus（乳桿菌屬）、Tsukamurella（束村氏菌屬）、Sporolactobacillus（芽孢乳桿菌屬）。

濃香型白酒；窖泥；厭氧細菌

好酒產(chǎn)于好窖，好窖依賴于好泥［1］。在生產(chǎn)濃香型白酒的窖池中，窖泥的好壞取決于其中微生物種群，優(yōu)質的窖泥中含有豐富的有利于釀酒的微生物群，這一微生物生態(tài)群包括甲烷菌、厭氧異養(yǎng)菌、乳酸菌、己酸菌等多種微生物［2］。在酒醅入窖發(fā)酵過程中，窖泥中的厭氧細菌對酒醅的糖化，乙醇產(chǎn)生等起到了一定作用，其代謝產(chǎn)生的窖香香氣是構成濃香型白酒窖香濃郁的重要組成部分［3］。許多高產(chǎn)己酸乙酯的細菌隸屬于厭氧菌，如巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）、梭狀芽孢桿菌（Bacillus fusiformis）及地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等［4］。所以，窖泥中的厭氧細菌不僅對酒醅發(fā)酵起著重要作用，而且對濃香型白酒香味產(chǎn)生有重大作用。

本試驗利用傳統(tǒng)的稀釋平板分離方法，結合厭氧培養(yǎng)的方式，從濃香型白酒的窖泥分離得到3株厭氧細菌。經(jīng)形態(tài)學、生理生化特征，參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行初步鑒定確定其屬名。實現(xiàn)了對濃香型白酒窖泥中分離的厭氧細菌的初步鑒定，豐富了濃香型白酒窖泥微生物菌種庫，同時也為對濃香型白酒酒醅發(fā)酵過程中香味物質的產(chǎn)生的研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

窖泥樣品∶采自瀘州鑫霸實業(yè)股份有限公司濃香型白酒發(fā)酵窖池2組2號窖池（窖齡30年），于窖底中心取樣，迅速放入?yún)捬鯕獯兄糜诒羞\回，4℃保藏，盡快分析。

1.2 主要試劑

結晶紫、番紅、過氧化氫、孔雀綠、可溶性淀粉、NaOH（分析純）、KNO3（分析純）、K2HPO4（分析純），刃天青等購自成都科龍試劑公司。

培養(yǎng)基∶TSA培養(yǎng)基購自青島海博生物試劑公司；YP培養(yǎng)基∶5 g蛋白胨，1.5 g酵母膏，0.01 g FeSO4·7H2O，20 g瓊脂，溶解于1 L水中，PH=7.2；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；改良的CSEA培養(yǎng)基，將土壤冷水浸出液改為窖池底發(fā)酵水稀釋液；胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）。

1.3 主要儀器與設備

生物顯微成像系統(tǒng)（55i+Ds-SM-U1，日本NIKON公司），影像分析菌落計數(shù)儀（SCAN 1200法國），恒溫培養(yǎng)箱（MJ-250，上海和羽良公司），厭氧工作站（DG-250，英國DWS公司），F(xiàn)ATO高壓滅菌鍋（華通機電集團有限公司）。

1.4 細菌的分離純化

1.4.1培養(yǎng)基的選擇

取少量樣品直接放入少量生理鹽水中，涂片染色直接鏡檢，指導培養(yǎng)基的選擇。選擇的結果用胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）進行純化和保藏，篩選時可用TSA培養(yǎng)基、YP培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）。

1.4.2菌體富集

按改良的CSEA培養(yǎng)基配方，配制450 mL液體培養(yǎng)基，分裝入3個三角瓶中，121℃滅菌15 min，待用；在厭氧工作站中，無菌條件取10 g窖泥，加入90 mL無菌水，充分搖勻，振蕩5～10 min，使泥樣充分打散，自然沉淀后取上清液；將準備好的液體培養(yǎng)基煮沸10 min，放入?yún)捬豕ぷ髡荆鋮s后，立即接種10 mL窖泥上清液，搖勻。37℃厭氧培養(yǎng)3～4 d。

1.4.3菌種分離

在厭氧工作站中，取富集液1 mL，涂布于平板上，TSA培養(yǎng)基、YP培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）四種培養(yǎng)基接三個平板，37℃培養(yǎng)3～4 d，挑單菌落，平板劃線37℃培養(yǎng)2～3 d。對每個平板的菌進行菌落形態(tài)觀察和鏡檢，對各種菌歸類，接種于胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG），平板劃線37℃培養(yǎng)2～3 d。

厭氧培養(yǎng)中選出的菌種進行好氧和微好氧篩選∶將選出的菌種接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）平板上，分別放到普通培養(yǎng)箱和帶有5%氧氣的氮氣袋中培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3～7 d，觀察是否生長。

1.4.4菌種的純化

將1.4.3選出的菌種，挑取單菌落，轉接于胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）平板，37℃培養(yǎng)3～4 d，依照此法轉接2～3次，進行純化，根據(jù)菌落特征及革蘭氏染色鏡檢確認后，挑取單菌落移入斜面，培養(yǎng)后備用。

1.5 生理生化鑒定

芽孢染色∶采用改良的Schaeffer—Fulton氏染色法［5］。

對分離菌種進行革蘭氏染色、莢膜染色、接觸酶、甲基紅、淀粉水解、反硝化、產(chǎn)氨、抗酸和吲哚等實驗［6］。

2 結果與分析

2.1 窖泥中細菌的分離純化

通過對瀘州鑫霸酒廠窖泥菌懸液富集，厭氧培養(yǎng)，從窖泥樣品中得到11株形態(tài)不同的菌株，經(jīng)過好氧和微好氧篩選，發(fā)現(xiàn)有4株菌能進行好氧生長，4株能在5%的微量氧氣生長，從而排除這8株菌株，從窖泥樣品中得到3株厭氧細菌。

分離純化得到的3株厭氧細菌，分別編號為YJ-01、YJ-02、YJ-03，對其個體形態(tài)、菌落形態(tài)觀察（圖1）和革蘭氏染色鏡檢（圖2）。YJ-01在培養(yǎng)基上呈白色、濕潤，易于挑取，無黏性，單體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性。YJ-02菌落呈淺黃色、濕潤，易于挑取，無黏性，單體為球狀，多個單菌粘連，革蘭氏染色呈陽性。YJ-03在培養(yǎng)基上呈白色略透明、較濕潤，易于挑取，無黏性，單體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性。

2.2菌種生理生化檢測及菌種簽定結果

試驗對3株分離純化好的厭氧細菌進行生理生化檢測，并檢測芽孢、莢膜等檢測，結果見表1。根據(jù)生理生化實驗結果，結合《伯杰細菌鑒定手冊》［7］對菌種進行了初步的種類鑒定，鑒定結果分別為∶YJ-01為Lactobacillus（乳桿菌屬）、YJ-02為Tsukamurella（束村氏菌屬）、YJ-03為Sporolactobacillus（芽孢乳桿菌屬）。

3 結束語

利用傳統(tǒng)的分離純化方法，結合厭氧培養(yǎng)方式可以從窖泥中分離出厭氧細菌。經(jīng)對其菌落形態(tài)、單體形態(tài)進行觀察和生理生化性質檢測，參照《伯杰細菌鑒定手冊》，獲得分離得到的單菌株的屬名或種名。這一過程雖然傳統(tǒng)簡單，但工作量大。由于實驗在分離與純化這兩個過程中利用了很多厭氧的特殊處理方法。運用樣品直接涂布，鏡檢觀察，可以在鏡檢中看到樣品中許多菌體形態(tài)及染色效果，指導培養(yǎng)基的選擇，本實驗選出的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）；由于厭氧菌不易培養(yǎng)和生長緩慢，先用添加環(huán)境營養(yǎng)液的培養(yǎng)基進行富集；對富集的菌懸液進行分離篩選；在篩選過程中培養(yǎng)基一定要新鮮，每次篩選做好有氧檢測（指示劑為刃天青）；厭氧培養(yǎng)中選出的菌種進行好氧和微好氧篩選，將選出的菌種接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）平板上，分別放到普通培養(yǎng)箱和帶有5%氧氣的氮氣袋中培養(yǎng)；同時對各株菌的生理生化檢測需要做大量的重復試驗，確保獲得該菌株準確的性質。

本次試驗應用傳統(tǒng)的細菌鑒定方法，鑒定了獲得的3株厭氧細菌，確定了其屬名，分別為Lactobacillus（乳桿菌屬）、Tsukamurella（束村氏菌屬）和Sporolactobacillus（芽孢乳桿菌屬）。表明傳統(tǒng)的細菌鑒定方法對厭氧細菌進行鑒定是切實可行的。這為大批量的菌種分離純化鑒定給出了一個經(jīng)濟、可行、實用的方法。如果為了更加深入的獲得菌種的信息，可以進行Biolog自動微生物鑒定［7］和分子生物學鑒定［4］等方法。

［1］胡承'應鴻'許德富'等.窖泥微生物群落的研究及其應用［J］.釀酒科技'2005(3）:34-38.

［2］陶勇'徐占成'李東訊'等.窖泥細菌群落結構演替及其與環(huán)境因子的相關性［J］.釀酒科技'2011(9）:42-46.

［3］黃治國'衛(wèi)春會'邊名鴻'等.濃香型白酒窖泥中兩株細菌的分離鑒定［J］.釀酒科技'2012(11）:36-38.

［4］趙輝'敞顏'王葳'等.濃香型白酒窖泥中高產(chǎn)己酸兼性厭氧細菌的分離鑒定［J］.食品科學'2012(5）: 177-182.

［5］宋瑛琳'王芳'田明.細菌芽孢染色方法比較的研究［J］.實驗室科學'2012(2）:122-123.

［6］黃秀梨.微生物學實驗指導［M］.北京:高等教育出版社'2006.

［7］布坎南R E'吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊［M］.8版.北京:科學出版社'1984.

Separation and Identification of Anaerobic Bacteria From Pit Mud of Luzhou-flavor Liquor

WANG Zan，LIGuanghui，LUO Huibo
（Liquor Making Biological Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China）

The production of Luzhou-flavor liquor depends on pits，and the quality of pits depends on pitmud microbes in which anaerobic bacteria is especially important.In order to realize the pitmud anaerobic bacteria，three strains of anaerobic bacteria are separated from pitmud of Luzhou-flavor liquor.After observing colony characteristics，microscopic performance and physiological-biochemical characteristics，referring to Bergey's manual of determinative Bacteriology，the three genus are preliminary identified and determined.The results show that the three strains of anaerobic bacteria are Lactobacillus，Tsukamurella，Sporolactobacillus separately.

Luzhou-flavor liquor；pitmud；anaerobic bacteria

Q93

A

1673-1549（2014）01-0016-03

10.11863/j.suse.2014.01.05

2013-09-02

四川省科技廳應用基礎項目（07JY029-026）；釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室開放基金項目（NJ2012-06；NJ2013-08）

王贊（1977-），男，四川自貢人，講師，碩士生，主要從事發(fā)酵工程方面的研究，（E-mail）379304035@qq.com