可注射型骺板軟骨水凝膠的制作及特性研究

鮑 興，許瑞江，黃靖香，李文超

解放軍總醫院，北京 100853 1小兒外科；2骨科研究所

兒童骺板損傷導致骨橋形成引起肢體短縮及內翻或外翻畸形是臨床常見疾病之一。目前，通過骨橋切除、自體脂肪填塞等方法治療兒童骺板小于35%的損傷面積獲得一定療效，但對于超過50%的大面積損傷，由于植入物僅起到填塞作用，沒有生長能力，療效欠佳。近年來，骺軟骨組織工程為兒童骺板損傷的修復帶來了新的希望。近年來組織工程技術的飛速發展極大地促進了骺板修復的實驗研究，支架材料的選擇與應用是組織工程骺板技術的關鍵問題。支架材料通常分為天然材料及人工合成材料，而根據空間構型及性狀又可將支架材料分為可注射性材料和三維多孔隙支架材料兩種。與三維多孔隙支架材料相比較，可注射性材料的優勢在于材料與所修復組織之間能夠很好地嵌合，保證了種子細胞及生長因子的高度均勻性，其膠體狀態亦能提供近似活組織的水合微環境。由于其自身的可注射性，修復組織損傷時可在透視引導下通過微創方式進行，并在原位凝膠化，操作簡單且安全、有效，避免了因有創剝離引起的軟組織及血供損傷。但通常使用的凝膠類可注射性支架材料，細胞外軟骨基質成分有限，不能充分滿足骺板軟骨特有的生理要求，而且與固態支架相比，缺乏良好的細胞貼附條件[1]。本實驗選取藻酸鈣(ALG)和骺板軟骨細胞外基質(CACECM)以及葡萄糖酸鈣復合物作為可注射型水凝膠，將CACECM三維支架的充分貼附性以及藻酸鈣凝膠的良好可塑性兩大優勢相結合，然后與骺板軟骨細胞混合后行體外培養，為可注射性組織工程化骺板軟骨材料的構建提供一條新的思路。

材料和方法

1 材料 胎牛骺軟骨(北京元亨金馬生物技術開發有限公司)、4周齡新西蘭白兔(解放軍總醫院骨科研究所提供)；培養基DMEM(美國Sigma公司)，標準胎牛血清(美國Hyclone公司)，Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，Hochest33258液(美國Sigma公司)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，三羥基甲基氨基甲烷(Tris北京科昊達生物公司)，苯甲基磺酞氟(PMSF美國Sigma公司)，DNase(美國Sigma公司)，RNase(美國Sigma公司)，TritonX-100(德國J.T.BAKER化學試劑公司)，藻酸鈣(美國Sigma公司，10%葡萄糖酸鈣(醫用標準)，番紅O染色試劑(Sigm a公司)，AB染色劑(Sigma公司)，甲苯胺藍染色劑(北京索萊寶科技有限公司)，HE染色劑(Sigma公司)，Ⅱ型膠原鼠抗豬單克隆抗體(美國Neomarkersabcam公司)；CO2恒溫培養箱(德國Hereus公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，超凈工作臺(北京半導體元件一廠)，Zeiss不銹鋼濾器(上海醫療器械廠)，磁力攪拌器(江蘇常州國華儀器公司)，Nikon光學顯微鏡及照相裝置(日本Nikon公司)，96孔培養板(平底型)，紫外分光光度計(Beckman公司)，掃描電子顯微鏡(日本日立公司S4800型)，恒低溫切片機(德國Reichert-Jang 2800E型)，BLX-E254紫外交聯儀(VILBFRL000URMAT公司)，多功能顯微鏡(日本Olympus Bx51TR型DP70CCD采集系統)，BioTek微量孔板分光光度計(美國伯騰儀器有限公司EPOCH型)。

2 CACECM的制備 用生理鹽水將胎牛骺板軟骨反復沖洗以除去雜質，在無菌臺中將其剪碎成1 mm× 1 mm×1 mm大小，加入含蛋白酶抑制劑苯甲基磺酞氟的Tris-HCL(Ph7.4)緩沖液，在4℃下進行超濕法粉碎。充分稀釋后進行差速離心，收集上清，加入1%TritonX-100持續振蕩24 h后去除殘余細胞成份，用脫氧核糖核酸酶5×104U/L及核糖核酸酶1×103U/L混合液在37℃條件下進行消化以去除核酸。制成2%CACECM，進行電鏡觀察，組織學檢查，DNA定量分析。

3 骺軟骨細胞的獲取和體外擴增 2周齡實驗用新西蘭白兔，全麻狀態下無菌手術取脛骨近端骺板軟骨塊，去除周圍骨質，置于事先準備好的無菌軟骨液中。6 h內采用解放軍總醫院骨科研究所紗巾組織塊培養法進行細胞分離培養[2]。分別取細胞懸液計算細胞產量和細胞成活率后置于75 cm2培養瓶中，37℃、5%CO2培養箱中培養，3 ~ 4 d換液1次，約10 d后第1次傳代，比例1∶3，傳代后生長迅速，約3 ~ 4 d后第2次傳代，比例同樣1∶3，再次3 ~ 4 d后細胞長滿瓶底，收集后細胞總數達1.0×108個，用于復合凝膠材料。

4 CACECM+ALG復合水凝膠的制備 將制備的2% CACECM與6% ALG及10%葡萄糖酸鈣按3∶6∶1比例混勻制備成溶液A；取單獨2% CACECM制成溶液B；取單獨6% ALG制成溶液C。分別行糖胺聚糖(GAG)含量測定。

5 水凝膠材料與骺板細胞的復合 CACECM、骺軟骨細胞、藻酸鈣和葡萄糖酸鈣復合后置于溫箱培養1周，行電鏡掃描觀察、AB染色、甲苯胺藍染色、番紅O染色、Hochest33258熒光染色及Ⅱ型膠原免疫免疫組化染色。

6 組織相容性及組織學檢測 制備出C+CACECM+ ALG復合物的懸液l ml，用1個1 ml注射器配以粗針頭抽取懸液，在懸液凝固前注射入實驗兔背部真皮下以檢測組織相容性，分2點注射，每點0.5 ml。8周后取材，行大體觀察、HE染色、甲苯胺藍染色、番紅O染色。

結 果

1 所制備CACECM的大體及組織學觀察 差速離心后的骺軟骨細胞外基質微絲呈乳白色、粘稠狀。電鏡下可見大量Ⅱ型膠原微絲(圖1)，組織學觀察番紅O、甲苯胺藍、AB染色均呈強陽性說明基質漿料中含有大量的糖胺聚糖成份，且微絲呈網狀分布，形態較規則，未見細胞碎片殘留。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色陽性說明獲得的漿料中含有Ⅱ型膠原成份。

2 骺軟骨細胞體外擴增 第二代骺軟骨細胞數量級l.0×108個，光鏡下觀察細胞鋪滿培養瓶底，此時細胞相互間緊密貼附，單個細胞呈狹長梭形，大多數細胞沿著胞體的長軸呈有序排列，集落中心的細胞密集呈漩渦狀排列(圖2)。

3 組織工程化骺板軟骨組織學檢測 CACECM、骺軟骨細胞、藻酸鈣和葡萄糖酸鈣復合物呈乳白色粘稠膠狀，易凝固。溫箱培養1周后：番紅O染色C+CACECM+ALG復合物顯示結構層次清楚，基質深層染色最紅，呈強陽性(圖3)；甲苯胺藍染色C+CACECM+ALG復合物均勻染成藍色，其中CACECM成分呈現深紫色塊狀和條索狀，提示其中的糖胺聚糖成分；AB染色可見細胞周圍的呈深藍色的酸性黏多糖，基質層淡藍色；Hochest33258熒光染色可見細胞核圓形或者橢圓，呈均一的藍染，未見明顯固縮、碎裂的強藍色細胞核，橢圓形的細胞圍繞在大量的網狀、相對連續的藍色條狀物(CACECM+ALG復合凝膠)周圍，結合緊密，復合物活性好，細胞和支架相容性好，細胞可以在水凝膠材料上繼續保持較好的活性；Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示C+CACECM+ALG復合物Ⅱ型膠原免疫熒光表達強陽性，證實組織中軟骨細胞具有分泌Ⅱ型膠原的功能(圖4)。電鏡下觀察水凝膠上可見大量骺板細胞生長(圖5)。

4 植入皮下8周后組織學檢測 HE染色顯示骺板細胞呈簇狀分布在支架空隙內，支架降解明顯，內部殘留部分柱狀結構，伴有明顯纖維組織包裹，無明顯炎癥細胞浸潤(圖6)。

5 CACECM+ALG復合凝膠DNA及GAG含量測定DNA濃度為62.38 ng/μl，GAG濃度5.26 μg/ml (復合前CACECM所測GAG濃度為2.39 μg/ml)。

討 論

目前應用較為廣泛的可注射性材料主要有藻酸鹽、膠原、Pluronic、纖維蛋白凝膠等，這些材料各自有其優越點和局限性。藻酸鹽是從馬尾藻等生物體內分離提取的一種天然多聚糖，來源較為豐富，價格低廉，其在支架構建方式上也較簡單。藻酸鈣水凝膠能很好地維持形狀且無毒性，利于種子細胞的黏附[3]。常溫狀態下，不需添加任何有毒試劑藻酸鈣便能形成三維立體多孔結構，其自身的力學及生物學性能也可隨著物理及化學因素的變化而改變，這些特點使其能與高分子聚合物、生長因子等其他材料一起構建出新型的復合材料[4]。Masuda等[5]利用藻酸鈣凝膠作載體培養軟骨細胞，然后收集細胞及細胞外基質，重新培養成不含藻酸鈣凝膠的軟骨組織，該軟骨組織在組織學結構上與正常的軟骨組織十分相似。利用藻酸鈣凝膠作為載體，應用于骺板軟骨的損傷修復亦會受到極大鼓舞。

相關研究認為ECM是個“蛋白信使”豐富的環境，具有良好的生物相容性，并且ECM能通過與軟骨細胞的相互作用來調節許多細胞相關的生物學過程，包括細胞的黏附、生長、分化及生存[6-8]。ECM是天然的細胞外基質成份，能夠提供骺板軟骨生長增殖所需的最原始的微環境。Nehrer等[9]使用多孔膠原—GAG復合物比較了I型膠原和Ⅱ型膠原復合物對狗關節軟骨細胞的影響，分別從細胞維持形狀、DNA和GAG合成幾個方面比較，認為Ⅱ型膠原更適合用作軟骨支架。Veilleux[10]等發現種植于Ⅱ型膠原—GAG基質上的軟骨細胞，其合成速率較I型膠原高。Ⅱ型膠原是ECM的主要成份，所以以此制備的水凝膠材料具有良好的生物相容性和生物活性，更有利于骺板軟骨細胞粘附、生長及增殖。

圖1 掃描電鏡下CACECM+ALG復合支架可見Ⅱ型膠原微絲圖 2 原代幼兔骺細胞呈集落性生長圖 3 番紅O染色顯示支架上骺細胞按照柱狀結構分布在支架上圖 4 Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示骺細胞和周圍支架材料呈強陽性Fig. 1 SEM showing typeⅡcollagen in stents made of CACECM+ALGFig. 2 Primary rabbit plate chondrocytes showing colony growthFig. 3 Safranin O staining showing distribution of plate chondrocytes in stentsFig. 4 Immunohistochemistry staining of typeⅡcollagen showing positive plate chondrocytes and materials around stents

圖5 電鏡掃描下可見大量骺板細胞生長 A： 低倍電鏡掃描下凝膠上可見大量骺板細胞生長； B： 高倍鏡下可見細胞生長良好圖 6 HE染色顯示骺板細胞呈簇狀分布在支架上，凝膠內部降解明顯Fig. 5 SEM showing growth of plate chondrocytes in hydrogel A:×200; B: ×1500Fig. 6 HE staining showing cluster distribution of plate chondrocytes and obvious degradation of hydrogel

本實驗將CACECM與藻酸鈣混合制成可注射型水凝膠材料，因為CACECM微粒直徑較小及其凝膠狀態，復合材料可以順利通過注射器具，同時輔以10%葡萄糖酸鈣，為細胞與CACECM貼附提供環境支持，將CACECM三維支架的充分貼附性、“蛋白信使”豐富的微環境以及藻酸鈣的良好可塑性這幾大優勢相結合，既彌補了藻酸鈣作為單一細胞外基質的不足，也避免了骺軟骨細胞外基質不能黏合成塊及塑形的缺點，極大地提高了組織工程化骺軟骨的生物學性能。從本實驗中所培養的組織工程化骺軟骨組織的定性及定量檢測結果上看，實驗制備的CACECM中DNA含量較低，說明其抗原性較低，生物相容性良好，電鏡下可見復合凝膠上骺板軟骨細胞生長情況良好，細胞較均勻地分布于凝膠上，未見明顯“空巢”現象。基質中GAG(糖胺聚糖等)和Ⅱ型膠原成分亦較充足，保證了足夠的力學強度及充分的細胞外基質環境。這些檢測結果表明新生類骺軟骨組織已具備一定的成熟度。下一步擬將CACECM、ALG及骺板軟骨細胞的復合物回植于受損的動物關節骺軟骨受力面，使之置于天然的骺板微環境中。通過關節的壓縮與牽拉作用以及關節液的刺激，對組織產生充分的直接和間接作用力，使組織工程化骺板軟骨更好地發揮縱向生長能力的作用，從而進一步觀察此可注射性復合水凝膠對骨骺損傷的修復效果。

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