肝素對(duì)勞力型熱射病大鼠模型早期干預(yù)的作用

陳潔坤，宋 青，李瑞生，張 婷，苗利輝，吳振華

1解放軍總醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100853；2解放軍第302醫(yī)院 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，北京 100039

熱射病(heat stroke，HS)是以核心體溫升高為特征的嚴(yán)重威脅生命的一類急癥，內(nèi)皮細(xì)胞損傷和彌散性微血管血栓形成是熱射病的一個(gè)突出特點(diǎn)[1]，其病理機(jī)制涉及到體溫調(diào)節(jié)、內(nèi)毒素、炎性細(xì)胞因子、內(nèi)皮細(xì)胞損傷與凝血功能障礙、熱休克等多個(gè)方面[2-4]。熱射病分為兩類：勞力型熱射病(exertional heat stroke，EHS)與經(jīng)典型熱射病(classic heat stroke，CHS)[5]。在臨床救治中，EHS更易出現(xiàn)凝血功能異常[6]，表現(xiàn)為血小板減少、凝血時(shí)間延長(zhǎng)、纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)和D-二聚體的升高等，病情發(fā)展也更加迅猛，死亡率高達(dá)30% ~ 80%[7-8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制EHS大鼠模型并預(yù)注射肝素，觀察生存率，對(duì)血液學(xué)指標(biāo)PLT、APTT及早期炎癥因子TNF-α進(jìn)行測(cè)定，以探討肝素對(duì)EHS大鼠早期干預(yù)的影響，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠60只，8周鼠齡，體重245 ~ 265 g，由解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫為(26±1)℃，相對(duì)濕度60%±5%，每日采用燈光照明，12 h晝夜節(jié)律變化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。

2 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備 環(huán)境訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)室(由國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所提供)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)(由國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所提供)，普通肝素鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022051)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑(上海西唐生物科技有限公司)，Powlab28sp生理記錄儀，直腸測(cè)溫探頭，定時(shí)秒表，促凝血清生化管，離心機(jī)，EP管，動(dòng)物解剖實(shí)驗(yàn)臺(tái)及解剖器材。

3 EHS模型制備 將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，均進(jìn)行6 d適應(yīng)性遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練。跑臺(tái)起始速度為10 m/min，訓(xùn)練時(shí)間為30 min，每天依次遞增1 m/min，訓(xùn)練時(shí)間保持在30 min，直至跑臺(tái)速度為15 m/min。訓(xùn)練過(guò)程中無(wú)大鼠死亡。將訓(xùn)練后大鼠隨機(jī)編號(hào)，由計(jì)算機(jī)軟件分析，按完全隨機(jī)分組方法將其分為3組：空白對(duì)照組(A組，n=8)、勞力型熱射病組(B組，n=26)、勞力型熱射病+肝素組(C組，n=26)。將環(huán)境訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)室溫度設(shè)置為35℃，濕度設(shè)置為70%，數(shù)控跑臺(tái)速度設(shè)置為15 m/min，連續(xù)運(yùn)行模式。治療及最終運(yùn)動(dòng)前不限制動(dòng)物的進(jìn)食和飲水。

4 動(dòng)物分組及處理 A組不采取任何處理，于室溫為(26±1)℃，相對(duì)濕度60%±5%的環(huán)境下靜置1 h。B組在尾靜脈注射0.9%的Nacl(1.0 ml/kg)。C組在尾靜脈注射肝素鈉注射液(稀釋為250 U/ml，1.0 ml/kg)。治療后0.5 h將B組及C組置入數(shù)控跑臺(tái)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。每10 min用生命體征檢測(cè)儀肛溫檢測(cè)探頭快速測(cè)定大鼠肛溫并做記錄，直至上升至42.5℃視為EHS造模成功取出置于室溫(溫度(26±1)℃，相對(duì)濕度60%±5%)[9]。

5 觀察指標(biāo) 對(duì)各組大鼠進(jìn)行一般狀態(tài)、體溫、血壓等記錄完成后，實(shí)驗(yàn)分兩部分。第一部分：B1組及C1組各10只大鼠進(jìn)行生存率比較，每小時(shí)觀察生存情況，共觀察8 h。第二部分：A組靜置1 h后(n=8)、造模后(B2和C2組，n=8)及造模后2 h(B3和C3組，n=8)，在各時(shí)間點(diǎn)將各組大鼠采用10%的水合氯醛1 ml腹腔內(nèi)注射麻醉，止血鉗夾尾無(wú)反應(yīng)后將大鼠取仰位固定于動(dòng)物手術(shù)架上，從左側(cè)頸外靜脈采取血液標(biāo)本并放血處死大鼠。

6 血液學(xué)標(biāo)志物測(cè)定 在各時(shí)間點(diǎn)(A組靜置1 h后、B2C2組造模后、B3C3組造模后2 h)采血5 ml，送臨檢科待測(cè)PLT、APTT。另留取3 ml抗凝血經(jīng)離心(1 500 r/min，15 min)，取上層血清ELISA法測(cè)定TNF-α含量，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料一律以±s表示。對(duì)多組間樣本均數(shù)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析。兩組均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。組間生存率比較采用Log-Rank檢驗(yàn)，做Kaplan-Meier生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般狀態(tài)觀察 A組大鼠行為正常，反應(yīng)靈敏，有明顯逃避行為。B組及C組大鼠在熱環(huán)境下跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后肛溫均上升至42.5℃，認(rèn)為EHS造模成功。造模后B組及C組大鼠精神萎靡，表情淡漠，呼吸深大，口鼻處濕潤(rùn)，口唇紫紺，腹部緊貼跑道，無(wú)逃避行為。

2 兩組生存率比較 10只B1組大鼠均在EHS發(fā)病后8 h內(nèi)死亡。同一時(shí)段內(nèi)，10只C1組大鼠5只死亡(P=0.021)，提示肝素預(yù)處理可提高大鼠的生存率。詳見(jiàn)圖1。

圖1 兩組大鼠8h生存率比較Fig. 1 Eight-hour survival rates of two groups

3 各組大鼠PLT、APTT、TNF-α的水平 與A組相比，B2B3組、C2C3組PLT顯著降低，APTT顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)；但與同時(shí)間點(diǎn)B組相比，血小板數(shù)量升高(P＜0.01)， APTT短于B組(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B2組、B3組與C3組TNF-α含量均高于A組(P＜0.01)，C2組TNF-α含量與A組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但C組兩個(gè)亞組大鼠TNF-α含量明顯低于同時(shí)間點(diǎn)B組(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組凝血功能指標(biāo)及TNF-α測(cè)定結(jié)果Tab. 1 Coagulation function and serum TNF-αlevel in different groups

討 論

目前開(kāi)展較多的是針對(duì)經(jīng)典型熱射病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，我課題組探索利用熱應(yīng)激合并運(yùn)動(dòng)進(jìn)行勞力型熱射病大鼠造模。本研究在溫度35℃、濕度70%的環(huán)境室中，動(dòng)物數(shù)控跑臺(tái)速度設(shè)置為15 m/min、連續(xù)運(yùn)行模式下大鼠進(jìn)行跑步。同時(shí)參照動(dòng)物熱射病診斷標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)：當(dāng)高溫應(yīng)激動(dòng)物體核心溫度達(dá)到42.5℃或動(dòng)脈收縮壓上升到達(dá)峰值后的下降點(diǎn)為標(biāo)志發(fā)生中度熱射病[10]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠直腸溫度達(dá)到42.5℃作為復(fù)制EHS大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)。既往研究觀察熱射病模型大鼠存活時(shí)間為21 min ~ 480 min不等，因此我們選擇480 min作為生存情況觀察時(shí)間[11]。從生存曲線可觀察到肝素預(yù)處理組在發(fā)病2 h內(nèi)無(wú)大鼠死亡，2 h后兩組大鼠生存率均呈不同程度地階梯狀下降，C1組生存率高于B1組。為了初步探討肝素對(duì)EHS大鼠早期干預(yù)的作用，我們將發(fā)病后及發(fā)病后2 h作為觀察時(shí)間點(diǎn)。

凝血功能紊亂是EHS常見(jiàn)的并發(fā)癥，由于高溫對(duì)血管內(nèi)皮的直接損傷導(dǎo)致，也被認(rèn)為是EHS發(fā)病率和病死率重要的影響機(jī)制之一[12]。近年來(lái)，炎癥和凝血交互作用在熱射病相關(guān)研究中受到了越來(lái)越多的重視[13]。有動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)表明熱應(yīng)激下宿主發(fā)生的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致多組織和臟器損傷，同時(shí)使早期細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β等升高[14-15]。炎性細(xì)胞因子的瀑布樣釋放引起的全身炎癥反應(yīng)引起了凝血系統(tǒng)的激活和抗凝血機(jī)制的抑制。內(nèi)毒素和細(xì)胞因子被認(rèn)為能激活白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，可以擴(kuò)大凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)并加速DIC的發(fā)生。同時(shí)，凝血活性成分可以刺激各種促炎的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，這些炎性介質(zhì)反過(guò)來(lái)進(jìn)一步刺激了凝血系統(tǒng)。有研究顯示高溫(43℃~ 44℃)可直接激活血小板凝集反應(yīng)[16]，使血液處于高凝狀態(tài)，易導(dǎo)致微循環(huán)障礙，促進(jìn)彌散性血管內(nèi)凝血的發(fā)生，增加了機(jī)體多器官功能衰竭綜合癥(MODS)及死亡。在我們的實(shí)驗(yàn)中，顯示熱應(yīng)激合并劇烈運(yùn)動(dòng)可使血小板降低，APTT延長(zhǎng)，如TNF-α的細(xì)胞因子升高，增加大鼠凝血功能障礙及全身性炎癥反應(yīng)，加速了大鼠的死亡。

肝素作為一種天然酸性黏多糖，能夠影響血小板聚集，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的抗凝血作用，可以預(yù)防或減輕血管內(nèi)彌散性凝血(DIC)的發(fā)生，是需要迅速達(dá)到抗凝作用的首選藥物。此外，已有報(bào)道稱肝素類抗凝血?jiǎng)┠馨l(fā)揮抗炎作用[17-18]，抑制缺血再灌注引起的炎癥因子激活，并且通過(guò)增加一氧化氮和前列環(huán)素的產(chǎn)生預(yù)防和減輕缺血后內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[19]。一些脂多糖刺激的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)肝素可下調(diào)促炎因子的表達(dá)，干擾TNF-α誘導(dǎo)的炎癥選擇性粘附分子的表達(dá)或功能性活動(dòng)來(lái)降低白細(xì)胞募集反應(yīng)和相關(guān)性炎性損傷[20]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾不具有抗凝作用的肝素樣物質(zhì)仍然具有抗炎作用，這說(shuō)明肝素的抗炎效用不完全依賴其抗凝特性[21]。在大鼠實(shí)驗(yàn)中，最大抑制炎癥反應(yīng)的普通肝素用量(500 U/kg)不會(huì)明顯延長(zhǎng)APTT[22]。微血管內(nèi)皮損傷、血栓形成、SIRS與HS組織器官損傷密切相關(guān)，阻斷炎癥反應(yīng)，抑制血栓可降低炎癥程度、改善預(yù)后[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝素可以在一定程度上改善EHS所引起的凝血功能紊亂，抑制炎性介質(zhì)TNF-α的釋放，改善微循環(huán)，從而提高生存率。本實(shí)驗(yàn)也表明肝素的抗炎活性是區(qū)別于抗凝功能的，肝素的某個(gè)量對(duì)炎癥因子TNF-a有抑制能力，并未顯著延長(zhǎng)APTT。臨床實(shí)際中，可考慮將某一劑量的肝素用于抗炎而不增加患者的出血風(fēng)險(xiǎn)，為小劑量肝素在EHS中的早期使用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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