一個Reis-Bucklers角膜營養不良遺傳家系的表型分析

程 玄，劉鐵城，秦麗敏，徐 玄，劉 偉，陳麗麗，張譯心

1解放軍總醫院 眼科，北京 100853；2解放軍總醫院海南分院 眼科，海南三亞 572000

Reis-Bucklers角膜營養不良(Reis-Bucklers dystrophy，RBCD)是角膜前部營養不良中較為罕見的的類型，通常為常染色體顯性遺傳病。TGFBI基因在角膜上皮細胞的表達于1994年被確定為在5p31，也是目前唯一發現與RBCD有關的致病基因。迄今為止，TGFBI基因的的致病突變位點有兩個，即R124L和R555Q[1]。除此之外，僅有1個報道證明RBCD與F540缺失有關[2]。根據2008年角膜營養不良國際委員會分型方法(The International Committee for Classification of Corneal Dystrophies，I3CD)[3]，角膜營養不良被分為上皮和上皮下營養不良、Bowman膜營養不良、基質層營養不良、后彈力層及內皮層營養不良。其中顆粒樣角膜營養不良(Granular corneal dystrophy，GCD)屬于基質層營養不良的一個類型。RBCD既被劃分為GCDⅢ型，也被劃分為Bowman膜營養不良兩個分型中的一種。RBCD作為累及角膜上皮的營養不良，患者常幼時起出現反復發作的角膜上皮糜爛，裂隙燈下可見廣泛的上皮缺損，斑點狀混濁位于上皮細胞和Bowman層之間。依據角膜混濁的特點和病理特征的不同，又將RBCD進一步分為地圖型(geographic pattern)與蜂窩型(honeycomb pattern)兩類[4]。目前，文獻報道認為TGFBI基因的特定突變導致特定的臨床表型，即R124L導致RBCD的地圖型，R555Q則導致RBCD的蜂窩型[1]。本研究對1個RBCD家系中9名患者和8名正常成員進行了詳細的臨床檢查和角膜變性表型分析，并對TGFBI基因全部外顯子進行檢測，明確該家系TGFBI基因突變類型并詳細闡述該突變所致的臨床表型，為臨床診斷及基因型-表型分析提供依據。

對象和方法

1 對象 本研究家系于2013年7月采自海南省三亞市，所有臨床檢查和血標本的采集在解放軍總醫院海南分院完成。詳細詢問家系成員病史，記錄患者出現首發癥狀時的年齡、癥狀以及病變發展特點。臨床檢查包括視力，眼壓，角膜，隙燈檢查和角膜照相以及淚液分泌檢查和角膜敏感性檢查。

2 外周血DNA制備 本研究通過解放軍總醫院倫理委員會論證后，所有受檢者均簽署知情同意書，年齡未滿18歲的成員征得本人同意后由父母簽署知情同意書。采集該家系中9名患者和5名正常人外周靜脈血8 ~ 10 ml，EDTA抗凝。DNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的離心柱型血液基因組DNA抽提試劑盒，按試劑盒使用方法抽提外周血白細胞DNA。-80℃保存待用。

3 TGFBI基因突變檢測 應用Primer3軟件在線設計引物，對TGFBI基因的第1~16個外顯子(exons)及5'和3'端非編碼區(untranslated region，UTR)以及內含子(intron)與外顯子拼接處序列進行PCR反應。引物由華大基因科技有限公司合成。PCR反應在25 μl體系中進行：2×Taq PCR MasterMix(含染料，藍色)12.5 μl，正反向引物各5 μl(引物原液加滅菌ddH2O稀釋50倍)，DNA模板2.5 μl。反應條件：94℃ 3 min，94℃ 30s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環，72℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠/紫外線鑒定，證實PCR擴增片段存在。PCR產物純化后，送至華大基因研究院進行直接測序，測序結果采用Chromas軟件(2.0)對序列進行對比分析。

結 果

1 RBCD家系患者癥狀 該家系共有3代14名成員，其中患者9例，正常人5例，RBCD性狀呈連續傳遞現象，男女發病比率為2∶1，其遺傳特征符合常染色體顯性遺傳(圖1)。所有患者均為雙眼發病，其臨床病史和體征符合RBCD診斷，平均年齡16 ~ 84(34.22±7.80)歲，首次發病平均年齡1 ~ 10(3.67±0.90)歲。首次發病癥狀均有雙眼對稱性畏光流淚，眼睛疼痛，具體表現為睡醒后角膜疼痛，刺激后疼痛加重，每次疼痛持續時間5 ~ 15(8.50±1.43) d。隨著年齡增長，患者眼睛疼痛癥狀減輕，疼痛減輕的年齡為7 ~ 31(6.00±4.06)歲。該家系9例中有4例(Ⅱ：5，Ⅲ：3，Ⅲ：4，Ⅲ：8)眼睛疼痛最終消失，平均消失年齡為(20.00±7.04)歲，但所有患者畏光癥狀持續存在。所有患者均表現為陽光下視力差，晚間光線暗時視力改善，可能與角膜混濁從角膜中央區起始并且隨病情進展，中央區角膜基質混濁水腫明顯有關。因患者角膜不平整，驗光無結果，因此，所有患者視力均為未矯正視力。有3例(Ⅰ：1、Ⅱ：2和Ⅱ：5)因角膜上皮嚴重糜爛和缺損，眼壓測量無結果顯示而無法記錄，家系內患者詳細臨床檢查數據見表1。

圖1 RBCD遺傳家系圖Fig. 1 RBCD family chart.

2 RBCD家系患者體征 家系內患者角膜混濁形態級程度有明顯差異。年齡大患病時間長者角膜受累程度比年齡小患病時間短的程度嚴重。第Ⅲ代所有患者均表現為角膜上皮地圖狀缺損(圖2A)，或灰白色顆粒狀混濁和毛玻璃樣改變。所有患者角膜周邊存在約0.5 ~ 1 mm的未受累的環形透明區域(圖2A)。部分患者角膜基質層可見少量線狀格子樣混濁(圖2B)或是雪花狀混濁(圖2C)。45歲以上患者表現為嚴重的角膜營養不良改變，出現角膜表面糜爛造成的局部隆起和混濁，呈致密灰白色改變(圖2D)，角膜表面斑片狀棕褐色改變，似鐵銹樣色素沉積(圖2E)，角膜上皮及前基質層表現為凹凸不平或缺損，水腫累及全基質層，彌漫水腫范圍明顯擴大(圖2F)。該家系患者除有角膜改變外，患者Ⅰ：1和Ⅱ：1角膜變性嚴重，伴隨雙眼眼球震顫，考慮可能與患者年幼即出現視力障礙、黃斑部發育異常不能固視有關。

表1 RBCD遺傳家系患者臨床表型特點Tab. 1 Clinical features of phenotype in RBCD patients

圖2 RBCD家系患者角膜營養不良臨床表型特點 A： 患者Ⅲ: 7左眼， 可見角膜上皮地圖狀缺損， 周邊透明角膜未受累； B： 患者Ⅲ: 3右眼，角膜基質層可見少量線狀混濁和中央區深基質層水腫； C： 患者Ⅲ: 6左眼角膜，顯示角膜上皮雪花狀混濁； D： 患者Ⅱ： 1右眼，顯示角膜表面糜爛造成的多個局部隆起和致密灰白色混濁； E： 患者Ⅱ: 1左眼，顯示角膜表面斑片狀棕褐色改變，似鐵銹樣色素沉積； F：患者Ⅱ： 7右眼，角膜上皮及前基質層表現為凹凸不平或缺損，以及廣泛角膜深基質層受累Fig 2 Clinic characteristics of RBCD patients with cornea dystrophy A: left eye of patientⅢ: 7, map-like coloboma of the epithelial cells, which evades marginal areas; B: right eye of patientⅢ: 3, line-like opacities were seen in the stroma, the central part of which presented with edema stretching to its deep district; C； fake-like opacities were seen in the epithelial cells of left eye of patient Ⅲ: 6； D： right eye of patient Ⅱ: 1, exhibiting multiple topical apophysis and dense gray opacities; E： left eye of patient Ⅱ: 1, lumping together different types of drab plaques resembling rust pigmentations; F： right eye of patientⅡ: 7, epithelial cells and the anterior part of stroma showing sags and crests fashion, and massive involvement of deeper layers of the cornea stroma

3 測序結果 包括先證者在內的所有患者均檢測到TGFBI基因c.418G＞T(p.R124L)的雜合突變，顯示100%的外顯率，即第4外顯子第418位堿基發生雜合突變，該突變導致TGFBI基因第418位堿基由G變為T，密碼子由CGC變為CTC，TGFBI蛋白第124位氨基酸由Arg(精氨酸R)變為Leu(亮氨酸L)。家系內正常人和100個正常對照成員DNA檢測未見該致病突變，表現為該家系內成員的基因型和表型共分離，該突變可能為此家系的致病突變位點。

討 論

本文報道了一個由TGFBI基因c.418G＞T(p. R124L)突變引起的RBCD家系。該家系患者在兒童時期出現反復發作的角膜上皮糜爛；角膜混濁起始于前彈力層且呈顆粒樣混濁。患者的臨床表現主要為畏光、流淚和疼痛，并多在10歲前發病，平均經過4.33(0 ~ 9年)年出現視力逐漸下降。這些臨床表現和體征與以往的報道相一致[5-8]。然而，該家系的臨床表型與以往報道不同的是角膜水腫累及的程度和范圍以及家系內不同患者隨著發病時間的不同其角膜變性的程度和形態有明顯不同[5-8]。

按照RBCD的特點角膜水腫主要局限在角膜上皮和前彈力層，而本研究家系的一個顯著臨床表型特點是角膜水腫突破前彈力層并累及深部基質層甚至是全基質層。國內報道顯示多數TGFBI p.R124L突變病人的角膜混濁均局限于前彈力層[7-10]，偶有涉及角膜基質層淺層，且進展較為緩慢，較少累積后彈力層。本研究家系中，所有患者角膜混濁均累及到角膜基質，9例患者中4例角膜全層混濁(含后彈力層)，這部分患者年齡為43 ~ 84(55.50±9.61)歲；而角膜未全層受累的患者年齡為16 ~ 19(17.20±0.58)歲。提示隨著年齡的增長，病情在不斷的向深部浸潤和加重；TGFBI p.R124L突變引起RBCD可能不僅局限在角膜上皮和前彈力層，也可累及深部角膜基質層或全基質層。

本家系內患者的臨床表型具有高度異質性。隨著年齡的增加患者角膜的病變逐漸加重，由起病初始的局限上皮和前彈力層的缺損至后期所表現出來的上皮角膜表面糜爛造成的局部隆起和混濁，呈致密灰白色改變，角膜表面斑片狀棕褐色改變以及病變累及深部角膜基質。這在先前TGFBIp. R124L突變引起的角膜變性家系國內報道的文獻中不多見。目前為止國內有相關研究發現在2個家系共10個RBCD患者出現了R124L突變，患者角膜病變均局限在前彈力層，呈現出地圖狀混濁。角膜混濁隨年齡的增長逐漸擴大、融合、密度增高[4]。也有研究顯示，TGFBIp.R124L突變引起RBCD僅局限在角膜中央區域直徑8 mm的上皮區域內呈現地圖樣混濁，周邊角膜為環形透明的未受累區，這和我們的報道相似[7-8]。一項34名法國人因TGFBIp.R124L突變引起的角膜變性家系的臨床特性研究也表明，大多數患者的表型都為一致性的病變，即迅速侵犯Bowman膜和淺表基質層的混濁，并且會并發角膜上皮的改變[11]。2000年國外報道了一家系9名TGFBI p.R124L突變引起的RBCD患者上皮地圖樣缺損位于角膜中央區，少數患者伴有角膜基質層的水腫，此外均未見其他特殊改變[12]。

綜上，我們描述了一個中國家系Reis-Bucklers角膜營養不良患者的臨床表型。在此RBCD家系中，TGFBI p.R124L突變引起的角膜變性在不同的患者中表現為高度表型異質性，包括角膜上皮地圖樣缺損，角膜表面糜爛造成的局部隆起和混濁，角膜表面斑片狀棕褐色似鐵銹樣色素沉積，以及水腫累及全基質層等。這些特點在同一家系中同時出現與以往TGFBIp.R124L突變引起的病變局限在角膜上皮和前彈力層的特點有明顯不同。

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