大鼠肝細胞微球皮下移植生成肝組織初探

張蘭，李則學，劉海亮，李沛雨

解放軍總醫院 普通外科研究所，北京 100853

對于先天性肝代謝紊亂及終末期肝病所致的急、慢性肝功能衰竭，肝移植是目前唯一有效的救治手段，但供體短缺嚴重制約該技術廣泛應用[1-2]。肝組織工程技術的發展為各種肝病治療提供一種潛在方法[1-4]。通過創建可植入工程化肝移植物體內再生工程化肝組織可為病損肝臟提供肝功能支持或直接對其進行修復[5-6]。迄今為止已證實包括肝細胞/支架材料復合物、肝細胞片層等多種肝移植物體內植入后可再生有功能的工程化組織[7-12]。肝細胞微球是肝細胞在非貼壁培養過程中相互聚集形成的三維類組織樣細胞聚集體；體外研究表明肝細胞在形成微球后可更好的保持其活性和功能[13-15]，但尚未見將其用于體內構建組織工程肝的報道。本研究旨在評價肝細胞微球皮下移植形成肝組織的可行性。

材料和方法

1 材料 共10只SD大鼠(200 g左右，購于軍事醫學科學院動物中心)，Ⅳ型膠原酶(美國Sigma公司)，肝細胞培養基(HepatoZYME-SFM，美國Gibco BRL公司)，D-Hank's液。倒置顯微鏡(Nikon)，光學顯微鏡(Olympus)，CO2培養箱(Heal Force)，超凈工作臺(北京冠鵬凈化設備有限公司)。

2 肝細胞分離 5只SD大鼠，經水合氯醛麻醉，開腹后自門靜脈插管固定后，立即向門靜脈灌注39℃無鈣、鎂的Hnak'液，并同時切斷下腔靜脈。當肝臟變白時，向肝臟中注入20 ml 39℃Ⅳ型膠原酶溶液。剪下肝臟，將其分別置于5個培養皿中，并加入相同濃度的Ⅳ型膠原酶溶液于37℃培養箱中繼續消化10 min。棄去膠原酶溶液，加入DMEM溶液，用鑷子撕去肝包膜，使肝細胞分散到溶液中。100目濾網過濾肝細胞，離心(100 g、5 min)收集肝實質細胞。用DMEM溶液洗滌肝細胞3遍，臺盼藍染色檢測肝細胞活性在90%以上備用。

3 肝細胞微球培養 新鮮分離的肝細胞接種在經瓊脂糖包被的培養皿中，加入肝細胞培養基HepatoZYME-SFM進行培養，每隔4 h手動搖晃1次以加速微球形成。

4 肝細胞微球體內植入 低速離心收集肝細胞微球，重懸于肝細胞培養基中。移植前將肝細胞微球置于注射器中，分別注射植入5只SD大鼠腹股溝處皮下腔中。

5 組織學觀察 1周后，手術切下腹股溝處組織，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切成10 μm切片，H.E.染色。光學顯微鏡觀察。

結 果

1 肝細胞微球形成 新鮮分離的肝細胞接種在瓊脂糖包被的培養皿上。體外培養3 d，光鏡下可見致密的肝細胞微球形成，外形為圓形，邊緣光滑；微球直徑在43 ~ 185 μm(圖1A)。組織學觀察顯示肝細胞微球保持天然肝細胞特有特征：胞體為圓形，核大而圓，多為雙核(圖1B)。

2 體內植入 皮下植入1周后，肝細胞微球成活并同周圍組織整合在一起。HE染色顯示植入的肝細胞保持肝特異的細胞形態，細胞為圓形，核大而圓，多為雙核。見圖2。

圖1 肝細胞在瓊脂糖包被的培養皿上形成肝細胞微球 A： 倒置顯微鏡觀察肝細胞在培養3d后形成肝細胞微球； B： 組織學檢查顯示肝細胞保持肝特異的形態學特征Fig. 1 Inverted microscopy showing formation of hepatic spheroids in agar-coated dish 3 days after plating (A) and histological examination demonstrating the specific morphology of hepatocytes (B)

圖2 皮下植入1周肝細胞微球(黑色箭頭)成活并形成肝樣組織Fig. 2 Surviving hepatic spheroids with formation of 3-dimensional liver-like tissue 1 week after subcutaneous transplantation (black arrow)

討 論

本研究證實大鼠肝細胞微球通過直接注射的方式植入腹股溝皮下腔中可以成活并形成三維肝樣組織，顯示出良好的促肝組織再生潛能。因腹股溝皮下腔具備空間較大、易于操作、安全性好，且可將移植物可逆的移去等優點，近年來在組織工程肝構建中日益受到重視[11-12]。然而，腹股溝血管網結構貧乏，對構建方法提出了更高的要求。迄今為止，皮下創建工程化肝組織均需要借助預先形成的血管腔；即便如此，所形成的工程化肝組織厚度也只有幾百個微米，也就是幾層細胞厚度[11-12]。此外，植入的肝細胞易去分化也成為皮下創建工程化肝組織需要克服的困難[11]。本研究證實肝細胞微球不僅可在皮下腔中成活、形成三維肝樣組織，而且很好的保持肝細胞特異細胞形態，表明其良好的促肝細胞植入和保持肝細胞特性的能力，具有潛在的用于在皮下腔進行工程化肝組織再生的潛能；而且，采用我們以前建立的肝單元融合創建工程化肝組織方法有望將肝細胞微球相互融合形成大塊工程化肝組織[16]。此外，移植肝細胞微球無需支架避免因其引入而引起的免疫排斥的影響。肝細胞微球可通過直接注射方式進行移植也使得該方法不僅操作簡單，而且可以最大限度的保存植入位點血管網為植入肝細胞提供良好的微環境。值得一提的是本實驗所建立的瓊脂糖微球培養法相對于生物反應器、搖晃培養法等不僅簡單，而且可以快速形成(3 d)肝細胞微球，具有良好的用前景[14-15,17]。綜上所述，我們創立的瓊脂糖肝細胞微球培養聯合肝細胞微球腹股溝皮下腔移植是一種新的、簡單、有效的體內創建工程化肝組織的方法。今后的研究應致力于構建更大體積的工程化肝組織及其功能的研究。

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