2-BFI對EAE大鼠中樞神經系統內小膠質細胞及MCP-1的影響

朱振國 陳艷艷 黃艷君 張元濤 王新施 鄭榮遠

●論 著

2-BFI對EAE大鼠中樞神經系統內小膠質細胞及MCP-1的影響

朱振國 陳艷艷 黃艷君 張元濤 王新施 鄭榮遠

目的 觀察2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉[2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline，2-BFI]對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠中樞神經系統內小膠質細胞及MCP-1的影響，并探討其保護EAE大鼠的作用機制。方法50只雌性SD大鼠隨機分為EAE組、2-BFI低劑量組、2-BFI中劑量組、2-BFI高劑量組及對照組，每組10只，采用豚鼠脊髓勻漿免疫誘導SD大鼠建立EAE模型，觀察每組大鼠發病情況并進行臨床癥狀評分；采用HE染色和LFB髓鞘染色觀察中樞神經系統的病理變化，對其炎癥浸潤程度加以評分；用免疫組化法測定腦干中激活的小膠質細胞及MCP-1陽性細胞數量。結果與EAE組比較，大、中、小劑量2-BFI干預組大鼠EAE發病率下降，臨床癥狀減輕，潛伏期延長，中樞神經系統內炎性細胞浸潤減少，2-BFI中劑量組在EAE臨床癥狀和病理學改變方面差異有統計學意義（P＜0．05）；免疫組化結果顯示，與EAE組比較，2-BFI中劑量組的活化的小膠質細胞數及MCP-1陽性細胞數均減少（P＜0．05）。結論中劑量2-BFI對EAE大鼠具有神經保護作用，其作用機制可能與2-BFI抑制小膠質細胞的激活，減少MCP-1的表達有關。

2-BFI實驗性自身免疫性腦脊髓炎 多發性硬化 小膠質細胞 MCP-1

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種主要以中樞神經系統髓鞘脫失、神經變性為主要病理特征的T細胞介導的自身免疫性疾病。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是其公認的動物模型，在組織病理學方面與MS有許多相似性。免疫機制因素在MS及EAE的發病機制中至關重要[1]。近年來有證據表明中樞神經系統小膠質細胞的激活及分泌的單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）等多種細胞因子可造成中樞神經系統炎性脫髓鞘損傷。2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉[2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline，2-BFI]是1996年由Lione等[2]報道的一種新型、有選擇性的、高親和力的咪唑啉2受體的激動劑。我們的前期研究發現I2R的非選擇性配體——咪唑克生對EAE大鼠有神經保護作用，其可減少小膠質細胞的激活及MCP-1表達[3-4]。但目前鮮有關于2-BFI對EAE大鼠影響的研究。本研究觀察2-BFI對EAE大鼠中樞神經系統內小膠質細胞及MCP-1的影響，探討其干預EAE的可能作用機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 成年雌性SD大鼠50只，6～8周齡，體重150～180g，清潔級；豚鼠12只，雌雄不拘，體重300～400g，均由溫州醫學院動物房提供。2-BFI購自英國Tocris公司；完全弗氏佐劑（CFA，含結核桿菌10g/ L）由美國Sigma公司提供；百日咳桿菌由衛生部上海生物制品研究所提供；MCP-1抗體由武漢博士德公司提供；Iba1抗體由Abcam公司提供；SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 EAE模型的誘導 根據本實驗室建立的方法[5]，處死豚鼠，取出脊髓，在玻璃勻漿器充分混勻，加入CFA，制成抗原乳劑，當天給予SD大鼠4個足墊皮下注射抗原乳劑0.4ml,同時腹股溝皮下注射0.1ml的百日咳菌苗（含1×109個菌體）。

1.2.2 實驗大鼠分組及藥物干預 將50只SD大鼠隨機分為5組，每組10只，分別作以下處理：（1）EAE組：EAE模型基礎上，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 ml/d，連續10d；（2）2-BFI低劑量組：EAE模型基礎上，腹腔注射2-BFI 1.5mg/（kg·d），連續10d；（3）2-BFI中劑量組：EAE模型基礎上，腹腔注射2-BFI 3mg/（kg·d），連續10d；（4）2-BFI高劑量組：EAE模型基礎上，腹腔注射2-BFI 6mg/（kg·d），連續10d；（5）對照組：大鼠4個足墊皮下注射0.4ml 0.9%氯化鈉溶液，每天腹腔注射1ml的0.9%氯化鈉溶液，連續10d。

1.2.3 動物行為學評價 免疫當日開始，每日早晚各2次觀察動物行為學方面的變化，予以詳細記錄。一直到第15天全部處死。臨床癥狀評分參考以下標準[6]：0分：無明顯異常；1分：尾巴無力；2分：輕微后肢無力；3分：嚴重后肢麻痹；4分：四肢麻痹；5分：瀕死或死亡。

1.2.4 病理學檢查 第15天處死大鼠，取出腦、脊髓，放于4%的多聚甲醛中固定24h。切取腦干做石蠟切片，進行HE染色（切片厚5μm）和LFB髓鞘染色（切片厚10μm）。根據Okuda等[7]的標準進行組織學評分：0分：無炎癥變化；1分：炎癥細胞浸潤僅限于血管周和腦脊膜周圍；2分：腦實質內輕微的炎癥細胞浸潤，1～20個/片；3分：腦實質內中度的炎癥細胞浸潤，21～100個/片；4分：腦實質內嚴重的炎癥細胞浸潤，＞100個/片。每張切片隨機計數5個視野后取平均值。

1.2.5 免疫組化法測腦干Iba1、MCP-1表達 石蠟切片脫蠟至水。純化水沖洗，PBS浸泡，枸櫞酸緩液中加熱沸騰熱修復抗原，室溫冷卻,3%H2O2室溫孵育15min，PBS沖洗，3min×3次。滴加一抗（Iba1一抗以1∶200或MCP-1一抗以1∶100稀釋）4℃過夜。PBS沖洗,5min×3次。滴加對應的二抗-HRP多聚體，37℃孵育20min, PBS沖洗，5min×3次。滴加DAB顯色。自來水充分沖洗，蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，封片。同時設陰性對照片，用PBS代替一抗，余步驟相同。在顯微鏡下以腦干組織內細胞染成棕褐色為免疫組化陽性染色，計數每張片內隨機5個高倍視野（×400）。取Iba1或MCP-1陽性細胞數的平均值。

1.3 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件，計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。計數資料以頻數與百分率比較，組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 動物發病情況 5組大鼠發病情況、神經癥狀評分和病理評分比較見表1。EAE組大鼠于免疫后第10天左右開始發病，先出現精神萎靡，活動減少、體重下降，尾部張力消失，尾巴拖地不能抬起，繼而后肢無力，癱瘓。

表1 5組大鼠發病情況、神經癥狀評分和病理評分的比較

由表1可見，與EAE組比較，3個2-BFI干預組的發病率下降，潛伏期延長，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）；2-BFI干預后神經癥狀評分較EAE組減輕，但僅2-BFI中劑量組較EAE組差異有統計學意義（P＜0.05）。而對照組未出現臨床癥狀，活動度正常，可見尾巴上翹、有力。

2.2 病理學改變 EAE組大鼠的腦干內見大量炎性細胞浸潤，并可見神經細胞變性、壞死（圖1）。按Okuda病理評分，EAE組評分最高，可見大量炎性細胞浸潤；給予2-BFI后，腦干內浸潤的炎性細胞數較EAE組減少，以2-BFI中劑量組炎性細胞浸潤減少最明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1、表2）。LFB髓鞘染色發現，EAE組大鼠腦干內存在廣泛的神經髓鞘脫失。給予2-BFI后，大鼠腦干內髓鞘脫失有不同程度減輕（圖2）。對照組大鼠腦干內未見炎性細胞浸潤和髓鞘脫失（圖1、2）。

圖1 5組大鼠腦干病理學改變（A：EAE組；B：2-BFI低劑量組；C：2-BFI中劑量組；D：2-BFI高劑量組；E：對照組，HE染色，×100）

圖2 5組大鼠腦干髓鞘染色變化（A：EAE組；B：2-BFI低劑量組；C：2-BFI中劑量組；D：2-BFI高劑量組；E：對照組；LFB髓鞘染色，×200）

2.3 2-BFI對EAE大鼠腦干內小膠質細胞的影響 小膠質細胞被認為是中樞神經系統的巨噬細胞，并參與EAE的發病過程。本實驗通過免疫組化檢測小膠質細胞的標志物——離子鈣接頭分子（Iba1）的表達來觀察活化的小膠質細胞的變化。EAE組發病大鼠中樞神經系統內活化的小膠質細胞數目明顯增加，形態上呈激活的“阿米巴”狀，染色加深（圖3A）。而3個2-BFI干預組大鼠腦干內小膠質細胞數目和染色強度較EAE組均減少，與炎癥反應嚴重程度相一致。其中以2-BFI中劑量組與EAE組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3、表2）；而對照組腦干內僅見少量細小分枝樣突起的小膠質細胞。

圖3 5組大鼠腦干內小膠質細胞的變化（A：EAE組；B：2-BFI低劑量組；C：2-BFI中劑量組；D：2-BFI高劑量組；E：對照組；免疫組化，×400）

2.4 2-BFI對EAE大鼠腦干內MCP-1表達的影響腦內MCP-1主要在小膠質細胞表達，正常腦組織不表達MCP-1，當中樞神經系統受到損害刺激，如免疫損害，小膠質細胞活化，在MCP-1作用下迅速增殖并向受損部位遷徙，加重免疫損害。EAE組大鼠腦干內可見較多細小突起著色的MCP-1陽性細胞，樹突數目增多，為胞質胞膜著色。3個2-BFI干預組大鼠中樞神經系統的MCP-1陽性細胞染色數目較EAE組均減少，染色較淺，但僅2-BFI中劑量組有統計學意義（P＜0.05）（圖4、表2）。對照組腦干內未見明顯MCP-1陽性表達。

3 討論

大量研究顯示，咪唑啉2受體（I2R）廣泛存在于中樞神經系統內，可參與腦內多種功能的調節，與腦卒中、帕金森病、脫髓鞘性疾病等多種疾病的發生有關[8]。它的非選擇性激動劑咪唑克生（1.5～4.5mg/kg）能夠明顯緩解EAE大鼠的脊髓損傷[3]。2-BFI是近年來才發現的與I2R有更高親和力的選擇性激動劑。參考韓釗等[9]的報道，本實驗選擇1.5mg/kg、3mg/kg和6mg/kg三種劑量的2-BFI對EAE大鼠進行干預，發現2-BFI中劑量組臨床癥狀明顯改善，神經癥狀評分明顯降低，炎性細胞浸潤明顯減少，而高、低劑量組作用不明顯，提示3mg/kg 2-BFI對EAE大鼠具有神經保護作用。2-BFI對EAE干預作用存在最佳劑量，推測可能的原因為劑量太小，效果變弱，但劑量太大，增加的效果可能被藥物的不良反應抵消。

圖4 5組大鼠腦干MCP-1表達的變化（A：EAE組；B：2-BFI低劑量組；C：2-BFI中劑量組；D：2-BFI高劑量組；E：對照組；免疫組化×400）

表2 2-BFI對大鼠腦干內小膠質細胞、MCP-1變化的影響

大量研究已證實小膠質細胞參與EAE的發病，它不但具有抗原遞呈細胞功能，而且產生多種細胞因子，從而趨化大量抗原非特異性淋巴細胞和活化的巨噬細胞，誘發和加重炎癥反應，最終導致脫髓鞘和神經系統的損害[10]。此外，EAE發生的一個關鍵步驟是抗原特導性T淋巴細胞和抗原非特異性單個核細胞進入中樞神經系統。MCP-1是重要的炎性介質，主要由小膠質細胞分泌，參與免疫反應的炎性細胞的趨化、激活等活動。研究發現主動免疫后的MCP-1-/-小鼠沒有出現EAE臨床癥狀，拮抗MCP-1或其受體的功能均可以大大減輕EAE的發生。因此，抑制小膠質細胞的活化和MCP-1的表達是改善EAE發病的有效途徑。厲芳等[11]研究發現2-BFI可以下調C57BL/6 EAE小鼠中樞神經系統內炎性因子IL-17的表達，從而減輕神經損傷。本實驗結果顯示，EAE組大鼠中樞神經系統內大量小膠質細胞活化和MCP-1表達增多，給予2-BFI干預后，在EAE模型大鼠發病高峰期可觀察到激活的小膠質細胞減少和MCP-1表達水平降低。提示2-BFI不但抑制了小膠質細胞活化，而且抑制EAE過程中趨化因子和炎性因子的表達，從而減輕了對炎性細胞的趨化、激活作用，最終減輕臨床癥狀。

綜上所述，中劑量3mg/kg 2-BFI能減輕EAE臨床癥狀和病理組織學損傷程度，對EAE大鼠具有神經保護作用，其機制可能與2-BFI抑制了中樞神經系統內小膠質細胞的激活，減少MCP-1的表達有關，但是具體的機制有待進一步深入研究。

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Effect of 2-BFI on microglia activation and MCP-1 expression in central nervous system of rats with experimental autoimmune en-cephalomyelitis

Objective To investigate the effects of 2-(-2-benzofuranyl)-2-imidazoline(2-BFI)on microglia activation and MCP-1 expression in central nervous system(CNS)of rat with experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)．MethodsFifty female Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into five groups：control group(n=10),EAE model group(n=10),low dose(1．5mg/kg)2-BFI group(n=10),intermediate dose(3 mg/kg)2-BFI group(n=10)and high dose(6mg/kg)2-BFI group (n=10)．The model of EAE was induced by injection of guinea pigs spinal cord homogenate(GPSCH)in SD rats．The severity of EAE was scored according to the signs and symptoms．The pathological changes were observed with Hematoxylin-eosin staining and Luxol Fast blue dyeing,then the degree of inflammatory infiltration was evaluated．The changes of activated microglia and MCP-1 positive cells in brainstem were counted by immunohistochemistry．ResultsCompared with EAE group,rats in intermediate dose 2-BFI treatment groups had lower incidence of disease,prolonged latency,decreased CNS inflammation and demyelination(P＜0．05)．Immunohistochemical results showed that the numbers of activated microglia and MCP-1 positive cells were significantly reduced in intermediate dose 2-BFI group compared with the EAE group(P＜0．05)．Conclusion2-BFI at intermediate dose(3mg/kg)has a beneficial neuroprotective effect on EAE,which may be related to inhibition of microglia activation and reduction of MCP-1 expression．

2-BFIExperimental autoimmune encephalomyelitis Multiple sclerosis Microglia MCP-1

2013-03-05）

（本文編輯：楊麗）

國家自然科學基金資助項目（81070960）；溫州市科技局資助項目（Y20090285）

325000 溫州醫科大學附屬第一醫院神經內一科（朱振國、陳艷艷、張元濤、王新施、鄭榮遠），婦產科（黃艷君）