金沙窖酒酒醅中產香酵母分離與鑒定

龐 博，王曉丹，魏燕龍，邱樹毅*

（1.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州金沙窖酒酒業有限公司，貴州金沙 551800；3.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025）

以微生物菌種為核心的發酵工業，其菌種是關鍵[1]，目前的產香酵母主要屬于產酯酵母和假絲酵母，是中國白酒中酯香的主要產生菌[2]，主要能為不同種類的白酒產酯增香，去除雜味，協調酒體，改善白酒的質量[3]，除了在白酒生香中有的廣泛應用，也逐漸適用于香料、果汁、食醋的生產加工中，所以具有高產酯能力、各種酯組合優化的產酯產香酵母的選育，是目前釀造行業急需研究且非常有意義的課題[4]。

本實驗主要從醬香型大曲酒的大曲和酒醅中分離具有高產酯增香功能的酵母，進行發酵實驗并對菌種進行鑒定、保藏，也為利用該菌種進行原生質體融合來選育能夠產香的釀酒酵母奠定基礎。本研究對該菌種的生物學特性進行了詳細的研究，并通過分子生物學手段進行初步鑒定，為后期進一步研究和在白酒中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅、大曲：金沙窖酒酒業有限公司。

1.1.2 培養基

（1）分離培養基

孟加拉紅瓊脂培養基[5]：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，瓊脂20 g，1/3 000孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水1 000 mL，氯霉素0.1 g。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基[6]：馬鈴薯汁1 000 mL，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。

（2）富集培養基

麥芽汁液體培養基：麥芽汁70 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

麥芽汁瓊脂培養基[7]：麥芽汁150 mL，瓊脂3 g，pH 自然，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯20 g，葡糖糖2.0 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水100 mL，pH值自然。

（3）篩選培養基

小麥高粱培養基：小麥∶高粱的質量比為1∶1，其中整粒高粱∶碎粒質量比為3∶1，小麥全部粉碎，攪拌均勻后90 ℃潤糧5 h，高溫蒸汽，121 ℃滅菌20 min，裝瓶。

（4）鑒定培養基

玉米粉瓊脂培養基：在60 g 玉米粉中加入少量水調成糊狀，再加水至1 000 mL，攪拌均勻后80～90 ℃水浴1.5 h，之后過濾（中間攪拌3～4 次），濾液補加水至1 000 mL，再加瓊脂15 g，加熱融化，趁熱用脫脂棉過濾，分裝到試管和三角瓶內，113 ℃滅菌30 min。

麥氏培養基：0.1%葡萄糖，0.18%氯化鉀，0.25%酵母膏，0.82%醋酸鈉，2%瓊脂，以蒸餾水1 000 mL配制，113 ℃滅菌30 min。

豆芽汁培養基：10%豆芽汁、0.5%葡萄糖，蒸餾水100 mL調配，pH 值自然。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母浸膏、2%瓊脂、蒸餾水100 mL配制。

尿素培養基[8]：蛋白胨0.1 g、氯化鈉0.5 g、磷酸二氫鉀0.2 g、尿素0.2 g、葡萄糖0.01 g、蒸餾水100 mL、酚紅（0.2%）0.4 mL、瓊脂2%，調pH至7.2 后過濾，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

EXTaq酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、10×PCR Buffer：寶生物工程（大連）有限公司；內轉錄間隔區（internal transcribed spacers，ITS）引物：Invitrogen 合成；Marker（DL 2000）：上海欣百諾生物有限公司。

1.2 儀器與設備

DY-CX1A電泳儀：上海趙迪生物科技有限公司；ABI PCR 儀：北京新陽創業科技發展有限公司；ABI 3730XL 測序儀：北京新陽創業科技發展有限公司；TDZ5-WS離心機：上海喬躍電子有限公司；SZX-IS1A恒溫培養箱：北京陸希科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產香酵母的分離與篩選

（1）初篩

酒醅樣粉碎，分別取25.0 g粉碎樣品于三角瓶中，并加225 mL無菌生理鹽水及玻璃珠，搖床中振蕩搖勻30 min。無菌條件下吸取1 mL菌懸液于裝有9 mL生理鹽水的試管中，進行系列稀釋，取10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度進行平板涂布于孟加拉紅瓊脂培養基上。28 ℃倒置培養3～5 d后挑取平板中酵母單菌落，于10 mL生理鹽水中制成菌懸液，再稀釋涂布到PDA固體培養基上，重復3～4次，直至獲得純菌種，分別斜面劃線低溫保藏。

（2）復篩

分別把初篩分離得到的菌株接種于麥芽汁液體培養基中，28 ℃搖床振蕩培養36 h后吸取4 mL菌液接種到盛有200 g高粱小麥培養基的三角瓶中，加入20 000 U糖化酶。模擬醬香白酒窖池內33 ℃發酵25 d，蒸酒，感官評定，初步篩選產香酵母。

1.3.2 GC-MS分析

通過GC-MS對產香酵母制備的酒樣進行風味成分檢測。分別取產香酵母所發酵的酒樣1 g，置于4 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm～50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在85 ℃頂空萃取30 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250 ℃）中，熱解析3 min進樣。

色譜柱為ZB-5MSI彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫45 ℃，保留2 min，以4 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（純度≥99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間1.5 min。離子源為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 125 V；接口溫度280 ℃；質量范圍20～450 amu。

對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖，確定了揮發性化學成分，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對含量。

1.3.3 產醬香酵母的形態特征

（1）菌落形態觀察

將分離接種純化過的菌株接種于最小必需培養基（minimum essential medium，MEA）固體培養基，28 ℃培養3 d，觀察菌落形態。

（2）細胞形態觀察

將分離接種純化過的菌株接種于MEA 斜面培養基上，28 ℃倒置培養36 h，無菌條件下用接種環挑取少許菌體置于載玻片上的無菌水中，蓋上蓋玻片，于顯微鏡下觀察。

（3）假菌絲觀察[9]

將分離接種純化過的菌株接種在玉米粉瓊脂平板上28 ℃培養2 d后觀察假菌絲有無。

（4）子囊孢子的觀察[10]

將分離接種純化過的菌株接種于麥氏培養基斜面上，28 ℃培養7 d后用接種環挑取少量生長在葡萄糖醋酸鹽培養基中的釀酒酵母于載玻片上，制片，干燥、固定后用孔雀綠芽孢染液染色，晾干之后于油鏡下觀察子囊孢子。

1.3.4 產香酵母的代謝實驗

（1）糖發酵實驗[11]

為制備碳源饑餓酵母，將純化過的酵母于25 ℃在氮源基礎培養基上饑餓培養3 d，后2.5%的接種量接種到12.5%豆芽汁中（加20 g/L葡萄糖），28 ℃靜置發酵14 d，每天觀察其產氣狀況。

（2）硝酸鹽利用實驗[12]

為制備氮源饑餓酵母，將純化過的酵母先在25 ℃用碳源基礎培養液培養5～7 d后稀釋涂布于碳源基礎培養基平板上，并點少量硝酸鹽于平板上，25 ℃培養3 d，觀察試劑周圍是否有酵母菌落生長。

（3）產類淀粉化合物測定實驗[12]

純化過的酵母接種在蛋白胨酵母膏葡萄糖（YPD）培養液中，28 ℃培養5～6 d后加入1滴Lugol’s 碘液，觀察是否產類淀粉化合物。

（4）脲酶實驗[12]

純化過的酵母接種于水解尿素實驗的瓊脂斜面上28 ℃培養6～7 d，觀察是否分解尿素。

1.3.5 產香酵母的ITSrDNA PCR測序及系統發育樹分析

提取樣品基因組DNA，PCR引物：ITS1：（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'），ITS4：（5'-TCCCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。模板DNA 5 μL，反應體系50 μL，PCR Premix 25 μL，引物ITS1和ITS4各0.5 μL，將ddH2O補足至50 μL。PCR 反應條件為：94 ℃5 min，94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，30個循環后瓊脂糖凝膠電泳檢測。將測序結果利用Blast 程序搜索同源序列，以Clustal X 軟件進行多重序列比對[13]，再用MEGA5.0軟件構建系統發育樹[14]。

2 結果與分析

2.1 產香酵母的感官評定

經過初篩，共從大曲、酒醅中分離出12株菌落形態不同的菌株，可將其分為3類，其菌落形態描述見表1。

表1 酵母菌菌落形態描述Table 1 Colony morphology of yeasts

為了研究表1中12株3類不同酵母發酵產酒情況，將該12株酵母按照1.3.1的方法進行實驗室模擬發酵產酒，并感官評定，其中氣味強度按照數字1～10氣味強度逐漸升高，結果如表2所示。

由表2可知，總體可接受性最大的為11號酵母，總體可接受性＞5的酵母為11號、10號、6號、2號酵母菌株，初步篩選出該4株產香功能酵母，進行后續實驗。

表2 不同酵母發酵產酒樣感官評定Table 2 Sensory evaluation of liquor samples

2.2 GC-MS分析

為分析初篩中4株酵母實驗室模擬發酵所蒸餾的酒樣中的風味成分，對酒樣進行了GC-MS分析，在4株酵母中對比篩選出1株產香優勢酵母FBKL2.0011，其GC-MS分析結果如圖1所示。

圖1 FBKL2.0011發酵酒樣揮發成分GC-MS圖譜Fig.1 GC-MS analysis results of aroma components of liquor sample fermented by strain FBKL2.0011

通過GC-MS總離子流圖譜進行解析后，在FBKL2.0011菌株發酵制備的酒樣中共鑒定出43種揮發性物質，結果見表3。

由表3可知，FBKL2.0011菌株發酵酒樣中共檢出43種香氣成分，包括醇類、酸類、醛類、酯類、酮類、烯烴類、芳香類化合物及烷烴類。揮發性物質中以醇類的含量最多，其中乙醇相對含量32.202%；其次是酯類如乙酸乙酯相對含量達8.009%。以醇類和酯類為主的香氣物質共同形成了白酒香氣。

表3 FBKL2.0011菌株發酵制備的酒樣中香氣物質組成Table 3 Aroma compositions in liquor sample produced by strain FBKL2.0011

續表

2.3 產香酵母的鑒定

2.3.1 菌落形態及顯微形態觀察

菌株FBKL2.0011在MEA固體培養基上，28 ℃倒置培養3 d，其菌落形態結果見表4及圖2。

表4 FBKL2.0011菌株在MEA培養基培養3 d的菌落形態Table 4 Colonial morphology of strain FBKL2.0011 cultured in MEA medium for 3 d

圖2 FBKL2.0011的菌落形態(A)及鏡檢圖(B)Fig.2 Colonial morphology (A) and microscopy examination (B) of strain FBKL2.0011

2.3.2 酵母菌部分代謝實驗

對酵母菌株FBKL2.0011進行生理生化特性試驗，其結果見表5。

表5 酵母菌生理生化特性形態Table 5 Physiological and biochemical properties of yeasts

由表5可知，酵母菌株FBKL2.0011無孢子，能利用葡萄糖發酵產生香氣成分，不能利用硝酸鹽，不產類淀粉物質及不能分解尿素。

2.3.3 分子生物學鑒定

為了進一步確定該酵母的分類地位，又在形態學和生理生化的基礎上進行了分子生物學鑒定。采用ITS序列分析方法，對菌株DNA序列進行擴增，將擴增出的核酸片斷與Marker條帶比較，有一條明亮的PCR 特征性條帶，如圖3所示，并且其分子質量大小與預測的理論值基本相符，菌株FBKL2.0011的PCR產物片段大小為817 bp。利用Blast程序與GenBank 中已登錄的基因序列進行比對，獲得已定名的與之相似的屬、種的相關信息。構建發育樹和同源性分析結果見圖4。由圖4可知，菌株FBKL2.0011 與uncultured compost fungus 同源性最高為99%。

圖3 PCR產物電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of PCR products

圖4 菌株FBKL2.0011的ITS序列系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of ITS sequences of strain FBKL2.0011

通過以上形態、生理學特征采用《酵母菌特征及鑒定手冊》介紹的方法[15]對該酵母分類，并結合其分子生物學鑒定結果，判斷判菌株FBKL2.0011 為酵母屬（Saccharomyces）。

3 結論

從金沙窖酒酒醅中分離到一株產香菌株，通過形態學、生理生化試驗和分子生物學鑒定，確定FBKL2.0011為酵母屬（Saccharomyces）。FBKL2.0011菌株發酵酒樣中共檢出43種香氣成分，包括醇類、酸類、醛類、酯類、酮類、烯烴類、芳香類化合物及烷烴類。揮發性物質中以醇類的含量最多，其中乙醇相對含量32.202%；其次是酯類如乙酸乙酯相對含量達8.009%。以醇類和酯類為主的香氣物質共同形成了白酒香氣。

今后將對該菌與實驗室篩選的功能細菌和霉菌聯合培養發酵條件進行研究與優化，期望發現能夠提高白酒生產過程中的高級醇和酯類含量的一種方法。

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