響應面法優化黑木耳乳酸發酵工藝

許 月，朱 丹，魏文毅，牛廣財 *，陳 璐，譚 慧

（1.黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319）

黑木耳在我國具有多年的栽培歷史，主產區在吉林、黑龍江、湖北等地，規模大、產量高、質量好。據不完全統計，我國出產的黑木耳品質和產量均居世界首位，年產量已達到100多萬t。全世界超過90%的黑木耳產自中國，我國生產的黑木耳除少部分出口外，絕大多數為國內消費。由于黑木耳是一種食藥兼用菌，營養價值高，且有很好的保健效果，被稱為“素中之葷”[1]。目前，我國黑木耳加工業還處于發展的初級階段，黑木耳加工產品的市場占有額不足整個銷售市場的5%[2]。近年來，人們對黑木耳含量較高的有效成分，如多糖、膳食纖維、黑色素、多酚等進行了較深入的研究[3-8]。同時，研制的黑木耳深加工制品種類也比較豐富，一類是非發酵制品，如黑木耳紙狀風味休閑食品、黑木耳脆片、黑木耳軟糖、黑木耳餅干、黑木耳果醬果凍、黑木耳冰淇淋、黑木耳核桃復合乳飲料等[9-17]；另一類是發酵類制品，如黑木耳發酵飲料、黑木耳酸奶等[18-21]。

隨著人們對保健食品的追求，發酵類制品越來越受到關注。目前，黑木耳乳酸發酵飲料、黑木耳豆奶的直投式乳酸菌發酵飲料等產品的研究開發較多[22-24]。但是，在黑木耳乳酸發酵制品的開發中，絕大多數是以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為菌種，而且必須添加奶源，這一定程度上限制了黑木耳發酵制品的種類和產品風味。本試驗擬選用植物乳桿菌和短乳桿菌作為發酵劑，無需添加奶源，采用響應面法對黑木耳乳酸發酵的工藝參數進行研究，以期為黑木耳乳酸發酵的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳：黑龍江省大慶市批發市場；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1.557、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）1.12：黑龍江省科學院應用微生物研究所；果膠酶（4×105U/g）：上海致化化學科技開發有限公司；纖維素酶（5×104U/g）：北京奧博星生物技術有限責任公司；木瓜蛋白酶（1.2×106U/g）：河北天旭實業有限責任公司；MRS肉湯培養基：青島海博生物公司；白砂糖（食品級）、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BCN-1360超級潔凈工作臺：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；THZ-82A水浴恒溫振蕩器：金壇市華城開元實驗儀器廠；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；DRP-9082型電熱恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；L420臺式低速自動平衡離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 測定指標

總酸測定：GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法[25]。

1.3.2 黑木耳乳酸發酵工藝路線

1.3.3 操作要點

黑木耳干品在常溫水中浸泡2～3 h，泡發好的黑木耳與純凈水按質量比1∶6的比例混合打碎，加入質量分數為2.4%的混合酶（果膠酶/纖維素酶/木瓜蛋白酶=1∶1∶8），在55 ℃條件下恒溫振蕩4 h得到黑木耳酶解液。在黑木耳酶解液中加入適量白砂糖，經高壓滅菌后接入乳酸菌，在適宜條件下培養，即完成黑木耳的乳酸發酵。

1.3.4 菌種的選擇

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，經滅菌后，分別接入植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis，LB），植物乳桿菌與短乳桿菌按1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1、1∶3、1∶4比例的混合菌，接種量為6%，在36 ℃條件下培養，一定時間后測其總酸含量。

1.3.5 單因素試驗

（1）發酵時間對黑木耳產酸量的影響

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，經滅菌后接入混合菌6%，在38 ℃條件下分別培養24 h、48 h、60 h、72 h、84 h，測其總酸含量。

（2）發酵溫度對黑木耳產酸量的影響

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，經滅菌后接入混合菌6%，分別在32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃條件下培養72 h，測其總酸含量。

（3）接種量對黑木耳產酸量的影響

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，經滅菌后，分別接入3%、4%、5%、6%、7%混合菌，在38 ℃條件下培養72 h，測其總酸含量。

（4）加糖量對黑木耳產酸量的影響

黑木耳酶解液中分別加入5%、6%、7%、8%、9%、10%白砂糖，經滅菌后，接入混合菌6%，在38 ℃條件下培養72 h，測其總酸含量。

1.3.6 響應面法優化發酵工藝

在單因素試驗基礎上，根據Box-Benhnken 中心組合試驗設計原理，以總酸（Y）為響應值，設計4因素3水平響應面分析試驗，因素水平編碼見表1。數據用Design 8.0.6.1程序分析。

表1 Box-Benhnken試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and coded levels of Box-Benhnken design

2 結果與分析

2.1 菌種的選擇

如圖1所示，菌種編號1～9分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）單一菌、短乳桿菌（Lactobacillus brevis，LB）單一菌、植物乳桿菌（LP）與短乳桿菌（LB）按1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1、1∶3、1∶4的比例混合菌。在培養24 h、48 h、60 h、72 h時分別測其總酸的含量。結果表明，在發酵48 h時，產酸增速最大。植物乳桿菌與短乳桿菌以2∶1比例混合菌在各時段產酸情況均較好，優于其他比例混合菌。這是因為混合菌種共同生長會產生協同發酵作用，植物乳桿菌發酵形成的良好環境，也促進了短乳桿菌的快速生長；同時，短乳桿菌的生長代謝也會促進植物乳桿菌的增殖，兩者的混合菌種能在較短的時間迅速產生乳酸，提高了黑木耳酶解發酵基質的產酸量。故菌種選為植物乳桿菌與短乳桿菌以2∶1比例混合菌。

圖1 不同菌種在不同發酵時間下對總酸含量的影響Fig.1 Effects of different strains on total acid content at different fermentation time

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 發酵時間對黑木耳產酸情況的影響

由圖2可知，48～72 h的發酵過程中，產酸較緩慢，總酸含量呈緩慢上升趨勢。當發酵至84 h時，增速最快，產酸含量最高達到10.18 g/L。在發酵至96 h時，總酸含量變化不大，趨于平穩，可見發酵已接近尾聲。由此，選擇發酵時間范圍60～84 h進行后續研究。

圖2 發酵時間對黑木耳產酸情況的影響Fig.2 Effects of fermentation time on acid production of black fungus

2.2.2 發酵溫度對黑木耳產酸情況的影響

由圖3可知，32 ℃時發酵速度較慢，產酸較低。34～38 ℃時，隨著溫度的升高，發酵逐步劇烈，產酸速度逐步提升，38 ℃時達到最高點，達到7.23 g/L。當溫度在38 ℃以后時，總酸含量沒有繼續升高反而開始下降，這與溫度較高，超過菌種最適宜的發酵溫度有關。綜合考慮總酸含量，選擇發酵溫度范圍36～40 ℃進一步優化。

圖3 發酵溫度對黑木耳產酸情況的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on acid production of black fungus

2.2.3 接種量對黑木耳產酸情況的影響

由圖4可知，接種量為3%時，產酸水平最低，為7.54 g/L。接種量為4%時，總酸含量最高，達到8.52 g/L。之后隨著接種量不斷增加，在接種量為5%～7%范圍時，總酸含量呈下降趨勢。這說明接種量過多或者過少，均不利于乳酸菌的繁殖和產酸。接種量過低時，由于其基數少，菌的數量增加相對緩慢；接種量過高時，由于較高酸度又會抑制乳酸菌的繼續繁殖與生長。所以，選擇3%～7%的接種量范圍進行后續優化試驗。

圖4 接種量對黑木耳產酸情況的影響Fig.4 Effect of inoculum on acid production of black fungus

2.2.4 加糖量對黑木耳產酸情況的影響

由圖5可知，在加糖量為3%～7%范圍時，隨著糖量的增加，總酸含量逐漸升高，在7%加糖量時達到最大值8.38 g/L。隨著加糖量的繼續增加，在9%～11%時，總酸含量出現了明顯的下降，可能是加糖量過高，滲透壓增加，乳酸菌利用不了所導致的。因此，選擇加糖量5%、7%和9%進行后續優化試驗。

圖5 加糖量對黑木耳產酸情況的影響Fig.5 Effects of the sugar addition on acid production of black fungus

2.3 響應面法優化黑木耳乳酸發酵的發酵條件

2.3.1 回歸方程建立與方差分析

響應面分析方案及試驗結果見表2，試驗結果通過Design 8.0.6.1數據分析軟件進行回歸分析，得到二次回歸方程為：

二次多項模型的方差分析見表3，其模型的F值為39.55，說明該模型有意義。P＜0.05，模型極顯著，其中X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32均為顯著性模型項。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Designs and results of response surface analysis

由表3可知，失擬項的F值為3.37，P＞0.05，表明失擬項相對于純誤差來說不顯著。該失擬項說明模型的擬合性較好，可以用于模型分析。模型的校正決定系數為R2=0.950 7，說明95.07%的試驗數據的變異性可用此模型來解釋。本模型的信噪比＞4，達到了23.415，該模型可用，說明該模型可以用于實際應用中。

2.3.2 最優值的確定

根據多元二次回歸方程，以總酸為響應值，對各因素水平進行優化，得到黑木耳乳酸發酵的最佳發酵工藝條件為發酵時間83.99 h、發酵溫度36 ℃、接種量3%、加糖量5%。在此條件下總酸的最大預測值為9.96 g/L。

2.3.3 驗證試驗

為檢驗試驗結果的可靠性，采用上述最優發酵條件進行黑木耳乳酸發酵試驗，同時考慮到實際操作的便利，將最佳條件修正為發酵時間84 h、發酵溫度36 ℃、接種量3%、加糖量5%。該條件下實際測得的總酸含量為（9.75±0.21）g/L，與預測值相差＜5%。可見，回歸方程的預測值與試驗值之間具有較好的擬合度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

3 結論

植物乳桿菌與短乳桿菌以2∶1的比例混合發酵黑木耳漿時，產酸效果最好。通過單因素試驗，確定各因素對黑木耳乳酸發酵產酸情況的影響。通過響應面優化方法，確定黑木耳乳酸發酵的最佳發酵條件為發酵時間84 h、發酵溫度36 ℃、接種量3%、加糖量5%。在此條件下的產酸量為（9.75±0.21）g/L。

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