PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織中的表達及與患者預后的相關性分析

張甘露 趙長林

PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織中的表達及與患者預后的相關性分析

張甘露 趙長林

目的 探討直腸癌組織PI3K和Akt蛋白表達及其與患者預后的相關性。方法應用免疫組化技術檢測PI3K和Akt蛋白在60例直腸癌組織、30例直腸腺瘤組織及10例正常直腸黏膜組織中的表達，并對60例直腸癌患者進行隨訪。結果PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織中均呈高表達，兩者表達呈正相關（P＜0．05）。PI3K蛋白表達水平與患者術前CEA水平、分化程度、臨床分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關（均P＜0．05或0．01）；與年齡、性別、腫瘤部位及形態無關（均P＞0．05）。Akt蛋白表達與患者術前CEA水平、臨床分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關（均P＜0．01）；與年齡、性別、腫瘤部位和形態、分化程度無關（均P＞0．05）。Cox回歸模型分析顯示遠處轉移是直腸癌預后的獨立危險因素（P＜0．05）。結論PI3K和Akt蛋白的高表達與直腸癌發生、發展密切相關并起協同作用。

直腸腫瘤 PI3K Akt預后

近年來，隨著人們生活水平的提高以及生活習慣的改變，直腸癌的發病率逐年增加。直腸癌的發生、發展是多基因、多步驟以及多因素協調累積的結果，涉及多個癌基因和抑癌基因及其調控信號通路的異常改變。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt/ PKB）信號通路在細胞的增殖、生長、分化過程中起著中心調控點的作用。本研究應用免疫組化技術觀察PI3K和Akt蛋白在結直腸癌組織中的表達，探討其在直腸癌發生、發展及轉移中的作用以及對患者預后的影響。

1 材料和方法

1.1 標本來源 收集大連大學附屬新華醫院2006-01—2009-12手術切除的直腸癌組織蠟塊標本60例，均經病理學檢查證實，所有患者術前均未進行放、化療及生物免疫治療，另收集直腸腺瘤組織蠟塊30例、正常直腸黏膜組織蠟塊10例，所有標本病例資料齊全。直腸癌標本中，男37例，女23例；年齡30～75歲，中位年齡53歲，其中≤60歲31例，＞60歲29例。腫瘤部位：上段（距肛緣＞7cm）9例，中下段（距肛緣＜7cm）51例；腫瘤形態：隆起型19例，潰瘍型41例；術前CEA：正常28例，升高32例；分化程度：高分化21例，中/低分化39例。臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期38例；術前淋巴結轉移：無23例，有37例；術前遠處轉移：無44例，有16例。臨床病理分期按美國癌癥聯合委員會（AJCC）/國際抗癌聯盟（ICC）結腸癌TNM分期標準（2010年，第7版），病理診斷均由病理科資深醫師經雙盲法核實確定。

1.2 實驗試劑和設備 即用型兔抗人PI3K單克隆抗體及兔抗人Akt單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，工作濃度為1∶100。即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒、檸檬酸鹽抗原修復液（pH=6.0）與PBS磷酸鹽緩沖粉劑（pH= 7.4）均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 實驗方法及步驟 本實驗采用免疫組化快捷型SP法。具體步驟：切片脫蠟水化，高壓抗原修復，3.00%過氧化氫孵育以阻斷內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，滴加一抗（PI3K/Akt）室溫孵育60min，PBS沖洗，滴加即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑，室溫孵育10min，PBS沖洗，滴加DAB溶液顯色，自來水充分沖洗，復染并封片。采用抗體公司提供的已知陽性乳腺癌切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷 PI3K和Akt蛋白均為胞質表達，為棕黃色顆粒。陽性細胞必須具備：細胞結構清晰，陽性染色定位準確，著色明顯高于背景。隨機選擇10個不同高倍鏡視野（×400），每個視野計數100個細胞，取其均值，按其中陽性細胞所占比例計分：陰性（-）：無棕黃色反應，隨機視野中無陽性細胞；弱陽性（+）：均勻分布淺棕黃色反應，陽性細胞比例＜25.00%；中等陽性（++）：深棕黃色反應，陽性細胞比例25.00%～50.00%；強陽性（+++）：棕黑色反應，陽性細胞比例＞50.00%。

1.5 隨訪 隨訪起始時間為手術時間，截止時間為2011-09-30，隨訪終點為患者死亡日期，隨訪方式采用門診復查及住院病歷、電話隨訪相結合的方式；中位隨訪時間為44.5個月（0.5～106個月），失訪5例，失訪率8.33%。

1.6 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件。計數資料的組間比較采用χ2檢驗、χ2檢驗的校正公式及Fisher精確檢驗；相關性檢驗采用Spearman等級相關分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，以Long-rank檢驗進行單因素分析，以Cox回歸模型進行多因素分析，得到患者預后的獨立危險因素。

2 結果

2.1 PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織、直腸腺瘤組織及正常直腸黏膜組織中的表達 PI3K蛋白在直腸癌組織、直腸腺瘤組織、正常直腸黏膜組織中陽性表達率分別為75.00%（45/60）、33.30%（10/30）、30.00%（3/ 10），直腸癌組織PI3K陽性表達率明顯高于直腸腺瘤組織和正常直腸黏膜組織（均P＜0.01）。Akt蛋白在直腸癌組織、直腸腺瘤組織、正常直腸黏膜組織中陽性表達率分別為60.00%（36/60）、33.30%（10/ 30）、10.00%（1/10），直腸癌組織Akt陽性表達率明顯高于直腸腺瘤組織和正常直腸黏膜組織（均P＜0.01），見圖1。

圖1 PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織、直腸腺瘤組織及正常直腸黏膜組織中的表達（A：PI3K在直腸癌組織中的表達；B：PI3K在直腸腺瘤組織中的表達；C：PI3K在正常直腸黏膜組織中的表達；D：Akt在直腸癌組織中的表達；E：Akt在直腸腺瘤組織中的表達；F：Akt在正常直腸黏膜組織中的表達；免疫組化SP法，×100）

2.2 PI3K和Akt蛋白表達的相關性 60例直腸癌標本中，PI3K和Akt蛋白同時表達陽性者占51.67%（31/ 60），同時表達陰性者16.70%（10/60），PI3K蛋白陽性而Akt蛋白陰性者23.30%（14/60），PI3K蛋白陰性而Akt蛋白陽性者8.30%（5/60）。Spearman相關分析提示，PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織中的表達呈正相關（r= 0.314，P＜0.05）。

2.3 PI3K和Akt蛋白表達與直腸癌患者臨床病理特征的關系 本實驗結果顯示，直腸癌組織中PI3K蛋白表達水平與術前CEA水平、分化程度、臨床分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關（均P＜0.05或0.01）；與年齡、性別、腫瘤部位及形態無關（均P＞0.05）。Akt蛋白表達水平與術前CEA水平、臨床分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關（均P＜0.01）；與患者的年齡、性別、腫瘤部位和形態、分化程度無顯著相關性（均P＞0.05），見表1。

2.4 直腸癌患者PI3K和Akt蛋白表達的單因素生存分析 經Kaplan-Meier生存分析，PI3K和Akt蛋白表達、腫瘤形態、分化程度、淋巴結轉移及遠處轉移與直腸癌患者生存期相關（均P＜0.05或0.01），而年齡、性別、腫瘤部位、術前CEA及臨床分期與直腸癌患者生存期無顯著相關性（均P＞0.05），見表2及圖2-4。

2.5 多因素生存分析 Cox回歸模型分析發現只有遠處轉移是直腸癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），而PI3K和Akt蛋白表達不影響直腸癌患者的生存期（均P＞0.05），見表3。

表1 直腸癌組織PI3K和Akt蛋白表達與患者臨床病理特征的關系（例）

3 討論

PI3K-Akt信號通路與細胞的增殖、分化及代謝方面密切相關，該通路的異常活化在腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用。PI3K是細胞內信號傳導有關的脂類第二信使，由調節亞基p85和催化亞基p110構成[1]。PI3K可分為3類，其結構與功能各異，其中研究最廣泛的為Ⅰ類PI3K，此類PI3K為異源二聚體，由一個調節亞基p85和一個催化亞基p110組成[2]。調節亞基含SH2、 SH3結構域，與含有相應結合位點的靶蛋白相作用。多種生長因子和信號傳導復合物，包括成纖維細胞生長因子（FGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）、血管生成素（Ang1）和胰島素都能啟動PI3K的激活過程。當PI3K的p85調節亞基被募集到臨近細胞膜的部位，p110亞基通過與p85亞基結合將底物磷脂酰肌醇2磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇3磷酸（PIP3）。PIP3可以和蛋白激酶B（PKB）的N端PH結構域結合，使Akt從細胞質轉移到細胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）的輔助下，通過使Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點（Thr 308）和絲氨酸磷酸化位點（Ser 473）磷酸化而使其激活。Liu等[3]的研究顯示PI3K在胃癌原發灶、轉移灶以及轉移淋巴結中均高表達。Johnson等[4]的研究顯示PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織中高表達，本研究也提示，直腸癌組織PI3K陽性表達率明顯高于正常直腸黏膜組織和直腸腺瘤組織。這表明PI3K的表達與直腸癌的發生、發展相關，其機制可能是通過促進腫瘤細胞增殖和抑制腫瘤細胞凋亡來實現的。

表2 PI3K和Akt蛋白表達相關性分析

圖2 PI3K不同表達的直腸癌患者的生存曲線

圖3 Akt不同表達的直腸癌患者的生存曲線

圖4 有遠處轉移和無遠處轉移直腸癌患者的生存曲線

表3 Cox多因素生存分析

Akt是一個在進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K下游主要的效應物。Akt可分為3種亞型（Akt1、Akt2、Akt3或PKBα、PKBβ、PKBγ）。活化的Akt通過磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子等下游因子，進而調節細胞的功能。持續激活的Akt主要作用于抗凋亡通路，拮抗由人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）介導的細胞凋亡。PTEN是一種腫瘤抑制基因，位于人染色體10q23，具有磷酸酶的雙重活性，負性調節PI3K-Akt信號通路的活性[5]。

伏代剛等[6]研究顯示潰瘍性結腸炎及直腸癌患者中Akt蛋白表達均高于正常組織，隨著潰瘍性結腸炎病程的進展，Akt蛋白表達逐漸增強，由此認為在潰瘍性結腸炎-腫瘤的疾病演進過程中，Akt蛋白表達的增強可能與潰瘍性結腸炎發生及癌變相關，Akt蛋白可能成為直腸癌早期的生物標志物。殷舞等[7]的研究發現PI3K和Akt蛋白在大腸癌腺瘤性轉化中表達異常，與腺瘤的癌變進展有關，其表達強度隨腫瘤的惡性轉化而增加，在腺癌中表達最強，這提示了Akt在直腸癌的發生中起重要作用。本研究結果顯示直腸癌組織中PI3K和Akt蛋白陽性表達率與直腸腺瘤組織和正常直腸黏膜組織相比較均有統計學差異，并且直腸癌組織中PI3K與Akt蛋白表達呈正相關，這與Baba等[8]的相關研究結果一致，提示PI3K-Akt信號通路在直腸癌組織中過度激活，可能在直腸癌的發生、發展中起到了重要作用。在患者的臨床病理特征方面，此通路過度活化與直腸癌患者術前CEA水平、臨床分期、淋巴結轉移及遠處轉移有關，其中PI3K蛋白過表達還與分化程度有關，而與其他病理因素無明顯相關性，提示PI3K-Akt信號通路的過度表達與腫瘤的惡性程度有關并可能影響到患者的預后。

關于直腸癌預后影響因素的分析也是近年來研究的熱點。有報道顯示淋巴結轉移是影響大腸癌患者預后的最重要因素。易呈浩等[9]研究顯示腫瘤浸潤深度、轉移淋巴結數、送檢標本淋巴結總數、鄰近器官受累、遠處轉移等是影響結直腸癌預后的獨立危險因素。汪建平等[10]的研究顯示腫瘤的大體分型、分化程度是影響結、直腸癌患者術后生存的獨立因素。Baba等[8]的研究顯示Akt是影響直腸癌的獨立危險因素。Cai等[11]的薈萃分析顯示Akt蛋白表達與卵巢癌的總生存期及無病進展時間有關，但現有的證據不足以支持PI3K-Akt作為臨床實踐中判斷患者預后的影響因子。在本研究中，PI3K蛋白及Akt蛋白表達、腫瘤形態、分化程度、淋巴結轉移及遠處轉移與直腸癌患者生存期相關，而年齡、性別、腫瘤部位、術前CEA及臨床分期與直腸癌患者生存無顯著相關性，進一步采用Cox回歸模型多因素分析發現只有遠處轉移是影響患者預后的獨立危險因素。PI3K和Akt蛋白表達與預后的相關性目前仍存在爭議，需要更多的臨床資料及數據進一步研究。

PI3K-Akt信號通路對于細胞增殖、分化和凋亡的調節是必要的，其活化與腫瘤發生及侵襲轉移的相關性提示以該信號通路為靶點的研究將有可能提高惡性腫瘤臨床治療的效果。隨著對PI3K-Akt信號通路分子機制研究以及對該信號通路在腫瘤侵襲轉移中的作用機制的深入研究，在不久的將來，以PI3K-Akt通路為靶點的藥物將在腫瘤的臨床治療中發揮越來越重要的作用。

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Expression of PI3K and Akt proteins in rectal cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of PI3K and Akt proteins in rectal cancer and its clinicopathological significance．MethodsPI3K and Akt proteins were stained immunohistochemically in 60 samples of rectal cancer,30 samples of rectal adenoma and 10 samples of normal rectal mucosa．ResultsBoth PI3K and Akt were highly expressed in rectal carcinoma tissue,and correlated with each other(P＜0．05)．The expression of PI3K was correlated with preoperative CEA level,tumor differentiation,clinical stage,lymph node metastasis and distant metastasis(P＜0．05 or 0．01),but not correlated with gender,age,tumor morphology and location(P＞0．05)．The expression of Akt was correlated with preoperative CEA level,clinical stage,lymph node metastasis and distant metastasis(P＜0．01),but not correlated with gender,age,tumor morphology,location and differentiation(P＞0．05)．Multivariate analysis identified that distant metastasis was the independent prognostic factor for rectal cancer(P＜0．05)．ConclusionPI3K and Akt proteins are highly expressed in rectal cancer and correlated with clinicopathological features of patients．

Rectal neoplasma PI3K AktPrognosis

2014-03-05）

（本文編輯：胥昀）

310013 杭州，浙江醫院腫瘤科（張甘露）；大連大學附屬新華醫院腫瘤科（趙長林）

趙長林，E-mail:zhongliuke2@163.com