丹皮酚抑制魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的實驗研究

王浩 耿趙銘 胡智偉 咼登俊

丹皮酚抑制魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的實驗研究

王浩 耿趙銘 胡智偉 咼登俊

目的 探討丹皮酚對魚藤酮誘導SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用及其機制。方法采用不同濃度丹皮酚預處理SH-SY5Y細胞，加入魚藤酮誘導建立帕金森病（PD）神經元損傷模型，以CCK-8檢測細胞增殖活性，流式細胞術檢測細胞凋亡，組織活性氧熒光定量法（DCFH-DA法）檢測細胞內活性氧（ROS）生成，并以JC-1染色檢測線粒體膜電位（MMP），同時檢測凋亡相關蛋白半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（caspase-3）活性。結果1μmol/L魚藤酮處理24 h后SH-SY5Y細胞增殖活性顯著降低，凋亡細胞數增多，ROS生成增加，MMP降低，caspase-3活性升高（均P＜0．01），說明PD神經元損傷模型建立成功。與魚藤酮處理組比較，丹皮酚(5、25μmol/L)預處理后SH-SY5Y細胞增殖活性提高，凋亡細胞數減少，ROS生成受到抑制，MMP改善，而caspase-3活性降低（P＜0．05或0．01）。結論丹皮酚(5、25μmol/L)對魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞凋亡具有抑制作用，其機制可能與丹皮酚的抗氧化作用等有關。

丹皮酚 魚藤酮 帕金森病 凋亡

帕金森病（Parkinson disease，PD）是中老年人常見的一種中樞神經系統退行性疾病。隨著人口老齡化，PD發病率達1.00%～3.00%，并呈上升趨勢[1-2]。PD主要病理特征是黑質多巴胺能神經元進行性丟失，并伴有路易小體形成。臨床表現為運動遲緩、靜止性震顫及姿態和步態異常等，部分患者還伴有焦慮抑郁、癡呆及自主神經功能障礙等癥狀[2-5]。目前PD的確切發病機制尚不完全清楚，有研究表明氧化應激與線粒體功能障礙在PD患者的黑質多巴胺能神經元凋亡中起重要作用[2-4]。

丹皮酚（paeonol）是從毛茛科植物牡丹和蘿藦科植物徐長卿全草中提取的中藥單體，具有抗氧化、抗過敏、抗炎等作用[6]。目前的體內外研究均表明丹皮酚具有一定的神經保護作用，但其能否抑制PD患者的神經元凋亡尚無報道。SH-SY5Y細胞屬于多巴胺能神經元，已被廣泛應用于神經病理模型的建立。魚藤酮（rotenone）是一種線粒體復合物Ⅰ（complexⅠ）活性抑制劑，能夠誘導模擬PD的神經元損傷病理生理改變，目前常用于PD的實驗研究[7]。本研究采用魚藤酮誘導建立SHSY5Y細胞損傷模型，從細胞水平評價丹皮酚對多巴胺能神經元凋亡的影響并初步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.l試劑和儀器 SH-SY5Y細胞株購自中科院上海細胞庫；魚藤酮、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）、4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、JC-1等購自美國Sigma公司；丹皮酚注射液（主要成分為丹皮酚，10mg/2ml·支）購自上海第一生化藥業公司，實驗時以無菌培養液配置；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；caspase-3試劑盒購自南京建成公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自美國BD Pharmingen公司。FACSalibur流式細胞儀為美國Becton Dickinson產品，Elx800酶標儀為美國Bio-TEK公司產品。

1.2 細胞培養與分組 SH-SY5Y細胞常規復蘇培養，待生長至80.00%融合時1∶4傳代，選取對數生長期細胞進行實驗。實驗分為對照組、魚藤酮處理組、魚藤酮+丹皮酚預處理組(1、5和25μmol/L 3個濃度)共5組。細胞接種于96或24孔板中，接種密度為1×105/ml，24h后換液并加入不同濃度的丹皮酚，培養1h后分別加入終濃度為1μmol/ L魚藤酮，對照組加入正常培養液，維持至實驗結束。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖活性 各組細胞接種于96孔板，分別處理達預定作用時間后每孔加入10μl CCK-8反應液，37℃反應10min后，酶標儀測定450nm的吸光值（OD值），計算細胞增殖活性。細胞增殖活性（%）=（處理組OD值/對照組OD值）×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞接種于100ml培養瓶中，待80.00%融合后分別予以不同處理，到達預定時間后消化、收集細胞，按照Annexin V-FITC試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 DCFH-DA法檢測細胞內活性氧（ROS）生成 細胞分別予以不同處理，到達預定時間后消化、收集細胞，以無血清的培養液重懸并加入終濃度為10μmol/L的DCFH-DA，37℃避光孵育30min，離心洗滌細胞后，熒光酶標儀檢測熒光強度（激發波長488nm，發射波長525nm），ROS值（%）=（處理組熒光強度/對照組熒光強度）×100%。

1.6 JC-1檢測細胞線粒體膜電位（MMP） 離心收集細胞后以PBS重懸，加入終濃度為10μg/ml的JC-1，置于37℃避光孵育30min，PBS洗滌2次后以熒光酶標儀檢測MMP變化（激發波長488nm，發射波長525nm）。MMP（%）=（處理組熒光強度/對照組熒光強度）×100%。

1.7 細胞內caspase-3活性檢測 收集細胞，以預冷的PBS洗滌后，細胞裂解液重懸，冰上孵育20min，14 000r/ min 4℃離心15min。取上清液用BCA法檢測蛋白濃度，剩余上清液檢測caspase-3活性，按試劑盒說明書操作：取5μl上清液加入caspase-3熒光底物（AC-DEVDAMC）中，避光孵育90min，熒光酶標儀檢測分析（激發波長360nm，發射波長460nm），結果標準化為每mg蛋白的熒光強度。計算公式caspase-3活性（%）=（處理組每mg蛋白熒光強度/對照組每mg蛋白熒光強度）×100%。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

2 結果

2.1 丹皮酚減輕魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞增殖活性下降 在前期預實驗中采用不同濃度魚藤酮誘導SH-SY5Y細胞損傷建立PD模型，CCK-8法檢測結果顯示魚藤酮1μmol/L作用24h后細胞增殖活性以及LDH釋放的變化較明顯（本文中未顯示相關結果），因此本研究選擇1μmol/L魚藤酮誘導SH-SY5Y細胞PD樣損傷。不同濃度丹皮酚在魚藤酮處理前1h加入，維持至實驗結束。結果顯示，與對照組比較，魚藤酮處理組細胞增殖活性下降（P＜0.01）；與魚藤酮處理組比較，丹皮酚（5、25μmol/L）處理后細胞增殖活性升高，具有統計學差異（P＜0.05或0.01），而且隨著丹皮酚藥物濃度增加，保護作用隨之增強，見表1。

2.2 丹皮酚抑制魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞凋亡 流式細胞術檢測結果表明，1μmol/L魚藤酮處理后SHSY5Y細胞凋亡明顯增多（P＜0.01），而丹皮酚（5、25μmol/L）預處理則減少細胞凋亡，且隨著丹皮酚藥物濃度增加，細胞凋亡率降低（P＜0.05或0.01），見表1。

表1 丹皮酚對魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞增殖活性與凋亡率變化的影響（%）

2.3 丹皮酚抑制魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞ROS產生 與對照組比較，魚藤酮誘導SH-SY5Y細胞內ROS的水平明顯升高（P＜0.01）；而與魚藤酮處理組比較，丹皮酚（5、25μmol/L）預處理可以明顯抑制魚藤酮誘導的ROS升高（P＜0.05或0.01），其中以25μmol/L組抑制效果更加明顯，見表2。

2.4 丹皮酚抑制魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞中MMP的下降 與對照組比較，魚藤酮處理組SH-SY5Y細胞MMP顯著下降（P＜0.01），提示線粒體能量耗竭；而與魚藤酮處理組比較，丹皮酚（5、25μmol/L）預處理可以明顯改善魚藤酮誘導MMP下降（P＜0.05或0.01），其中以25μmol/L組抑制效果更加明顯，見表2。

表2 丹皮酚對魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞ROS生成與MMP變化的影響（%）

2.5 丹皮酚抑制魚藤酮誘導的細胞caspase-3活化 與對照組SH-SY5Y細胞比較，魚藤酮處理組caspase-3活性上調，具有統計學差異[（100.00±5.64）%vs（131.88± 7.65）%，P＜0.01]。而1μmol/L丹皮酚預處理后細胞caspase-3活性為（122.20±7.51）%，與對照組比較有統計學差異（P＜0.01）；而5μmol/L丹皮酚預處理后活性為（112.76±8.85）%，25μmol/L丹皮酚預處理后為（105.29±6.28）%，與魚藤酮處理組比較，（5、25μmol/L）丹皮酚預處理后細胞caspase-3活性受到抑制（P＜0.05或0.01），且以25μmol/L組效果更加明顯。

3 討論

PD是由多種因素共同所致的一種中樞神經系統退行性疾病，以中腦黑質多巴胺能神經元進行性丟失為主要病理特征，并伴有殘存神經元內路易小體形成[2-3]。PD的發生機制與遺傳因素、氧化應激、線粒體功能障礙、炎癥以及細胞凋亡等密切相關，目前認為細胞凋亡是PD發生的中心環節，因此如何減少神經元凋亡已成為防治PD的研究熱點之一[2-4]。

丹皮酚是從毛茛科植物牡丹和蘿藦科植物徐長卿的全草中提取出來的中藥單體，具有抗氧化、抗炎、抗菌等藥理作用[6]。研究發現丹皮酚對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用，能夠減輕血腦屏障通透性，抑制ROS生成[8-9]；同時丹皮酚還能減輕β-淀粉樣蛋白誘導的海馬神經元損傷[10]；并可以有效地改善腦缺血、糖尿病及阿爾茨海默病小鼠認知障礙[9-12]。此外，丹皮酚還能調節小膠質細胞介導的炎癥[13]。目前，體內外研究均表明丹皮酚具有一定的神經保護作用，但其對于神經元凋亡是否存在保護作用尚未見于報道。

因此，本研究中采用魚藤酮建立PD神經元損傷模型，探討了丹皮酚對魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響。研究結果提示丹皮酚對魚藤酮誘導的SHSY5Y細胞凋亡有一定程度的保護作用，并呈濃度效應關系，以丹皮酚（5、25μmol/L）作用明顯。

在PD發病機制中，氧化應激與線粒體功能障礙在神經元凋亡中發揮了重要作用，氧化應激產生的ROS可引起線粒體復合物Ⅰ（complexⅠ）功能障礙，而后者又會促進ROS進一步生成，兩者互相作用導致惡性循環[14]。線粒體是細胞凋亡的主要開關，線粒體功能下降，不僅促使ROS生成增多，同時也會引起ATP合成減少，線粒體膜去極化，造成MMP下降及滲透性通道的開放，進一步將會引起細胞色素C釋放，繼而活化依賴于caspase的凋亡信號通路，最終導致細胞凋亡，影響組織器官功能[3,14-15]。本研究中以DCFH-DA法檢測細胞內ROS生成，以JC-1檢測MMP來反映線粒體膜通透性的改變。結果顯示1μmol/L魚藤酮作用24 h，SH-SY5Y細胞內ROS生成增多，MMP下降。而丹皮酚（5、25μmol/ L）預處理后可部分抑制魚藤酮誘導的ROS生成，并使MMP回升，筆者推測該效應的部分機制與丹皮酚的抗氧化活性有關。

caspase-3是內、外源性凋亡通路共有的終末效應酶，在細胞凋亡的過程中發揮重要作用。正常狀態下以無活性的酶原形式存在于細胞質中，在多種凋亡刺激信號作用下被活化，裂解相應底物，最終導致凋亡發生[3,16]。因此，檢測細胞內caspase-3活性也是凋亡檢測的重要手段之一。本研究結果表明魚藤酮處理后，SHSY5Y細胞caspase-3活性顯著上調，而丹皮酚預處理（5、25μmol/L）使caspase-3活性下降。

綜上所述，本研究結果提示，魚藤酮通過促使ROS生成增多、MMP下降以及caspase-3活化等機制誘導神經元凋亡，而丹皮酚預處理可抑制以上效應，該保護作用可能與丹皮酚抗氧化活性有關，而丹皮酚的具體神經保護機制尚有待于進一步深入研究。

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Paeonol prevents SH-SY5Y cells from rotenone-induced apoptosis

Objective To investigate the effects of paeonol on rotenone-induced apoptosis in SH-SY5Y cells．MethodsSH-SY5Y cells were pretreated with paeonol and then rotenone was added in the culture medium．Cell viability was detected by CCK-8 assay．The apoptosis rate was assessed by flow cytometry．Cellular ROS production were detected by DCFH-DA．The mitochondial membrane potential(MMP)was determined by JC-1 staining and the caspase-3 activity was measured by caspase-3 kit．Results1μmol/L rotenone significantly decreased cell viability,enhanced the apoptotic rate and overproduced ROS,reduced MMP and increased caspase-3 activity．Compared to rotenone treated group,5,25μmol/L paeonol significantly ameliorated cell damage,inhibited apoptotic rate and ROS overproduction,alleviated the decrease of MMP and reduced the caspase-3 activity．ConclusionPaeonol can prevent SH-SY5Y cells from apoptosis induced by rotenone,which may be associated with its anti-oxidant ability．

PaeonolRotenone Parkinson disease Apoptosis

2014-05-28）

（本文編輯：胥昀）

浙江省自然科學基金項目（Y2110679）

310012 杭州，浙江省立同德醫院神經內科（王浩、胡智偉、咼登俊）；濰坊醫學院臨床醫學系（耿趙銘）