雷公藤內酯醇洗脫支架對小型豬冠狀動脈內膜增生及細胞分裂周期基因2、基質金屬蛋白酶2表達的影響

胡德喜，陸東風，林剛毅

(1.湖南益陽市中心醫院急診科，413000;2.廣州醫學院第一附屬醫院心血管內科;3.廣東汕頭市中心醫院老干科)

當前，臨床廣泛應用的藥物洗脫支架主要是雷帕霉素洗脫支架(SES)和紫杉醇藥物洗脫支架(PES)，探索一種既能有效降低再狹窄又能減少血栓形成的新型藥物支架是當前的研究熱點。本課題組從1999年開始對雷公藤內酯醇的作用機制進行研究，希望發揮我國中醫藥的優勢，研制具有自主知識產權的國產藥物洗脫支架，使更多的患者獲益。本實驗探討雷公藤內酯醇藥物洗脫支架抑制再狹窄的機制，為雷公藤內酯醇藥物洗脫支架的進一步研制和臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 小型豬冠狀動脈標本制備 18只健康國內西藏小型豬(動物合格證號:DB31/T240-2001)，雄性，4～6月齡，體質量20～25 kg，隨機分3組，分別為不銹鋼裸支架組、雷帕霉素洗脫支架組、雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg組。每只豬選擇左前降支和右冠脈分別置入同一類型支架各1枚(型號均為2.5 mm×23 mm大小)，共置入支架36枚。設立7 d和28 d兩個觀察點，7 d觀察點每組各2只豬，28 d觀察點每組各4只豬。術后7 d和28 d復查冠狀動脈造影后放血處死動物，取出心臟，4%中性緩沖甲醛70 mm Hg加壓灌注固定30 min后分離冠狀動脈支架血管段，0.9%氯化鈉注射溶液沖洗。

1.2 定量評價支架血管段組織損傷及內膜增生

1.2.1 取材部位 用剪刀垂直于管腔，剪取支架血管段的近、中和遠端三個部分為病理組織標本，各段標本長度約2 mm，4%中性緩沖甲醛固定。

1.2.2 切片和染色 帶金屬支架標本硬塑料包埋后，用骨科切片機切片，切片厚度5 μm，每段血管切1片，每支架共3片，所有切片用HE染色制備光鏡標本。每個支架段血管的參數都取每個支架近、中和遠三段血管3個切片測量值的平均值。

1.2.3 微圖像分析 應用Carl Zeiss顯微鏡和AxioVision圖像處理系統測定冠狀動脈外彈力膜層橫斷面積、支架上平均內膜厚度、支架間平均內膜厚度，觀察血管平滑肌細胞(VSMC)的移行、增殖及內膜厚度變化，拍照以作記錄。按Gunn等［1］報道的方法計算血管損傷積分，評估三組的血管損傷程度。評分方法如下:0分，內彈力膜完好未受壓;1分，內彈力膜受壓，變形＜45°;2分，內彈力膜受壓，變形＞45°;3分，內彈力膜受壓撕裂;4分，外彈力膜受壓撕裂。每個血管截面的損傷積分為五個金屬柱桿積分的平均值。

1.3 免疫組織化學染色觀察基質金屬蛋白酶2(MMP2)、細胞分裂周期基因2(CDC2)的蛋白表達水平

1.3.1 取材部位 取硬組織切片后剩余的支架血管段組織在解剖顯微鏡下，用眼科鑷子小心抽去血管中的支架，盡量完整保留血管壁結構。然后將血管段石蠟包埋，制備蠟塊備用。

1.3.2 病理切片的制備 取已制備好的血管段石蠟包埋塊作3 μm厚的連續切片，45℃水浴中展開，粘附在經多聚賴氨酸處理過的載玻片上，分別做好標記，室溫下自然風干。

1.4 結果判定 MMP-2和CDC2免疫組織化學分析陽性表現為細胞漿內有棕黃色顆粒樣沉淀。用Image Pro Plus 5.0圖像軟件系統分析，選取固定大小研究區域測量平均灰度值，并且每次測量平均灰度值時以同一血管周圍的背景作為對照進行標準化以觀察表達的蛋白含量。其原理是在同一光照強度下，陽性區域強弱不同表達為所吸收或透過光的數值是不同的，由此顯示出灰度的差異。測量目標顏色越深，透過的光線越少，灰度值越小，顏色越淺，透過的光線越多，灰度值越大。因此，灰度參數可相對定量反映陽性強弱的變化，可用于衡量組織或細胞中某種成分的含量［2］。根據此原理，在光強度及曝光時間相同的條件下，每例切片在10×40光學顯微鏡下任選5個視野，測定其陽性顆粒的平均灰度值，以此代表冠狀動脈組織中MMP-2和CDC2的蛋白含量。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析處理，多個樣本均數比較采用方差分析及SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 冠狀動脈支架段血管平均損傷積分和血管內膜增生情況 見表1。

支架植入后7 d，各組動脈內膜支架撐桿周圍可見呈不連續線性排列的紅染物質。裸支架組可見增生內膜幾乎全部包繞支架撐桿，雷帕霉素洗脫支架組、雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg組支架撐桿兩側可見內膜增生，管腔面支架裸露。各組支架上內膜厚度、支架間內膜厚度差異有統計學意義(P＜0.01)，見表1。

支架植入后28 d各組紅染物質進一步增加，呈連續線性排列，血管內膜完全內皮化。裸支架組支架上內膜厚度、支架間內膜膜厚度較雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg組、雷帕霉素洗脫支架組厚，差異有統計學意義(P＜0.01)，見表1。支架間內膜厚度兩兩比較裸支架組與其他各組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，雷帕霉素組和雷公藤內酯醇100 μg組相似(P=0.259)，見表 1。

2.2 免疫組織化學檢測

2.2.1 MMP-2表達情況 支架植入后7 d，MMP-2在小型豬冠狀動脈壁中膜SMC胞漿中表達，表現為細胞漿內有棕黃色顆粒樣沉淀。MMP-2在動脈壁組織表達的平均灰度值裸支架組(7.02±2.92)、雷公藤內酯醇洗脫支架 100 μg組(30.56 ±4.62)、雷帕霉素洗脫支架組(32.34±4.76)，表達的平均灰度值差異有統計學意義(P＜0.01)。裸支架組中強表達，雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg組、雷帕霉素洗脫支架組弱表達，各組間兩兩比較裸支架組與其他各組比較差別有統計學意義(P＜0.05)，雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg和雷帕霉素洗脫支架組相似(P=0.495)。

支架植入后28 d，平均灰度值裸支架組(11.66±3.33)、雷公藤內酯醇洗脫支架 100 μg 組(21.19 ±1.22)、雷帕霉素洗脫支架組(21.46 ±2.66)，各組MMP-2表達的平均灰度值差異有統計學意義(P＜0.01)。MMP-2在裸支架組陽性強表達，在雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg組、雷帕霉素洗脫支架組弱表達，兩兩比較和7d組相似。

2.2.2 CDC2表達情況 免疫組織化學分析示支架植入后7 d，CDC2激酶在小型豬冠狀動脈壁中膜SMC胞漿中表達，表現為細胞漿內有棕黃色顆粒樣沉淀。CDC2激酶在動脈壁組織表達的平均灰度值裸支架組(13.31±1.91)、雷公藤內酯醇洗脫支架100μg組(26.81 ±6.66)、雷帕霉素洗脫支架組(25.46±3.64)，各組CDC2表達的平均灰度值差異有統計學意義(P＜0.01)。各組間兩兩比較裸支架組與其他各組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg和雷帕霉素洗脫支架組相似(P=0.596)。裸支架組中強表達，雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg、雷帕霉素洗脫支架組弱表達。

表1 各組病理組織學檢測結果(±s)

表1 各組病理組織學檢測結果(±s)

注:7 d觀察點每組各2只豬，28 d觀察點每組各4只豬

組別 外彈力膜面積(mm2)損傷積分(分)7 d支架上內膜厚度(μm)7 d支架間內膜厚度(μm)28 d支架上內膜厚度(μm)28 d支架間內膜厚度(μm)裸支架組 6.54 ±0.29 2.24 ±0.21 11.09 ±0.23 21.23 ±2.15 180.38 ±9.23 195.53 ±12.25雷帕霉素組 6.77 ±0.32 2.20 ±0.25 0 5.11 ±1.24 80.77 ±8.30 111.51 ±11.25雷公藤內酯醇100 μg 組 6.57 ±0.35 2.18 ±0.22 0 5.13 ±1.40 97.72 ±7.51 114.76 ±9.42 t值0.221 0.124 0.547 3.215 8.413 13.404 P值0.457 0.302 0.035 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

支架植入后28 d，CDC2激酶在動脈壁中膜SMC和內膜胞漿中都有表達。CDC2在小型豬冠狀動脈壁組織表達的平均灰度值裸支架組(8.24±5.38)、雷公藤內酯醇洗脫支架 100 μg 組(16.51 ±3.57)、雷帕霉素洗脫支架組(18.40 ±2.26)，各組CDC2表達的平均灰度值差異有統計學意義(P＜0.01)。各組間兩兩比較裸支架組與其他各組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg和雷帕霉素洗脫支架組相似(P＞0.05)。CDC2激酶在裸支架組中強表達，雷公藤內酯醇洗脫支架 100 μg、雷帕霉素洗脫支架組弱表達。

3 討論

支架術后再狹窄的機制主要包括:血管內皮細胞的損傷與增生;血管內膜平滑肌(VSMC)的過度增殖與遷移;血栓形成;細胞外基質的作用;炎性反應和血管重塑［3］。作為免疫抑制藥物，雷公藤內酯醇可應用于許多自身免疫性疾病的治療。由于它的生理活性強，具有顯著的抗炎、抗腫瘤、及免疫調節作用，在臨床上得到了廣泛的應用。本次研究實驗結果亦表明，在各組血管損傷程度基本相同的情況下，雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg組和雷帕霉素洗脫支架組抑制內膜增生程度相當，與裸支架比較差異有統計學意義(P＜0.01)。雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg組劑量能很好的抑制血管內膜過度增生，預防再狹窄。

MMPs是參與降解全身各種組織細胞外基質(ECM)的蛋白酶家族［4］。血管平滑肌細胞增殖及從中膜向內膜的遷移是動脈再狹窄發展過程中的關鍵環節，而由VSMC產生的MMPs對細胞外基質的降解促進SMC的遷移。周曉莉等［5］發現大鼠頸動脈球囊損傷1 d后MMP-2的表達升高，7 d后達高峰，14 d后逐漸下降。本研究通過免疫組織化學發現MMP-2染色陽性的是動脈中膜的SMC，意味著動脈組織中MMP-2由SMC產生。支架植入后7 d和28 d，MMP-2在裸支架組中強表達，雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg和雷帕霉素洗脫支架組弱表達，差異有統計學意義(P＜0.05)。支架置入后，SMC增殖及從中膜向內膜的遷移是動脈再狹窄發展過程中的關鍵環節，而由SMC產生的MMPs對細胞外基質的降解促進了SMC的遷移。雷公藤內酯醇100 μg能抑制MMP-2的表達，減少細胞外基質降解，抑制SMC的遷移增殖，減少新生內膜形成，為預防管腔狹窄的重要機制之一。

CDC2激酶是細胞分裂周期(CDC)基因2編碼的相對分子質量為34×103的蛋白質，屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，它只有與細胞周期蛋白結合才具有激酶的活性，故又稱細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)［6］。我們通過免疫組織化學分析顯示支架植入后7 d CDC2激酶在小型豬冠狀動脈壁中膜SMC胞漿中表達，28 d時在動脈壁中膜SMC和內膜胞漿中都有表達。7 d和28 d時，裸支架組CDC2激酶強表達;雷公藤內酯醇洗脫支架100 μg、雷帕霉素洗脫支架組弱表達。本研究結果提示雷公藤內酯醇100 μg洗脫支架與雷帕霉素洗脫支架對CDC2表達的影響相同，使CDC2基因轉錄受抑所導致的活性化CDC2蛋白表達減少，細胞G2/M周期停滯，這可能為雷公藤內酯醇洗脫支架抑制SMC的增殖和新生內膜形成，預防支架內再狹窄的又一重要機制。

［1］ Gunn J，Arnold N，Chan KH，et al.Coronary artery stretch versus deep injury in the development of in-stent neointima［J］.Heart.，2002，88(4):401-405.

［2］ 鄭偉，汪寶軍，葉立民.灰度值、光學密度值與免疫組織化學分析片陽性表達強弱的關系［J］.臨床與實驗病理學雜志，2003，19(5):566-567.

［3］ 黃璟，陸東風.冠狀動脈支架術后再狹窄發生機制及介入治療進展［J］.嶺南心血管病雜志，2006，11(3):213-215.

［4］ 劉榮清，林佳靜，孫伯堅，等.類風濕關節炎和骨關節炎滑膜滑液中MMP-2和MMP-9的比較［J］.寧夏醫科大學學報，2013，35(1):23-25.

［5］ 周曉莉.雷寒羅格列酮抑制大鼠頸動脈球囊損傷后新生內膜增生和基質金屬蛋白酶-2的表達［J］.基礎醫學與臨床，2012，32(6):687-692.

［6］ 李波，闕祥勇，李新志.CDC2激酶與腫瘤的相關性研究進展［J］.廣東醫學，2012，33(4):566-567.