原因不明自然流產中芳香烴受體與Treg／Th17細胞因子平衡的關系

郭紅玲，徐風娟，茅彩萍，莊燕燕，夏飛

（1．太倉市第一人民醫院婦科，江蘇太倉215400；2．蘇州大學附屬第一醫院生殖醫學中心，江蘇蘇州215006）

原因不明自然流產中芳香烴受體與Treg／Th17細胞因子平衡的關系

郭紅玲1，徐風娟1，茅彩萍2，莊燕燕2，夏飛2

（1．太倉市第一人民醫院婦科，江蘇太倉215400；2．蘇州大學附屬第一醫院生殖醫學中心，江蘇蘇州215006）

目的：檢測芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）在原因不明自然流產患者蛻膜組織中的表達，探討其表達與蛻膜中調節性T細胞（T regulatory cell，Treg）／Th17細胞因子平衡之間的關系。方法：選擇原因不明復發性流產患者23例作為觀察組，另選擇正常早孕婦女30例作為對照組；采用實時熒光定量PCR法檢測兩組蛻膜組織中AhR、叉頭樣轉錄因子p3（forkhead box p3，Foxp3）、IL-10及維甲酸孤獨核受體γ（retinoic acid receptor-related orphan receptorsγ，ROR-γ）等mRNA表達，并對AhRmRNA表達與Foxp3、IL-10、ROR-γmRNA表達作相關分析。結果：觀察組蛻膜中AhRmRNA、ROR-γmRNA表達明顯高于對照組，但Foxp3 mRNA、IL-10 mRNA則明顯低于對照組（P均＜0．05）。兩組蛻膜中AhRmRNA表達與ROR-γmRNA表達呈正相關（P均＜0．05），與Foxp3 mRNA以及IL-10 mRNA表達則無明顯相關性（P均＞0．05）。結論：原因不明自然流產患者蛻膜中AhRmRNA及Th17細胞因子表達均升高，而Treg細胞因子表達下降，Treg／Th17細胞比例下降。AhR表達增高與Th17細胞因子上調相關。

自然流產；芳香烴受體；調節性T細胞；Th17

自然流產病因復雜，機制尚不明確。現代免疫學觀點認為，正常妊娠的維持依賴于母體對胎兒建立的局部免疫耐受環境，對父方來源的胎兒組織發生免疫識別和產生免疫反應。母方來源的免疫細胞、胎兒來源的絨毛膜外滋養細胞和其他間質細胞匯集于母胎界面［1］，這些細胞通過表達表面分子建立母胎之間的信息傳遞網絡，從而形成耐受妊娠的免疫微環境，有利于正常妊娠的維持。

調節性T細胞（T regulatory cell，Treg）是調控母胎界面局部免疫耐受形成的重要因素，對正常免疫耐受和妊娠的維持起重要作用。Treg為CD4＋CD25＋T細胞，具有免疫負性調節功能，其分泌的細胞因子主要有IL-10、TGF-β等。叉頭樣轉錄因子p3（forkhead box p3，Foxp3）為Treg細胞標記分子，反映其活性水平［2］。研究發現［3］，在小鼠孕早期轉移體外擴增的Treg能夠保護胚胎避免自然流產。Th17細胞是一類以高分泌IL-17為特征的CD4＋T細胞，維甲酸孤獨核受體γ（retinoic acid receptor-related orphan receptorsγ，ROR-γ）為其特異性調節因子。研究發現［4］，復發性流產患者外周血Th17細胞明顯增多。

許多研究發現，母胎界面Treg／Th17平衡失調是引起原因不明自然流產的重要原因。有報道稱［5］，與健康妊娠者相比，復發性流產患者外周血中CD4＋CD25brightFoxp3＋Treg細胞減少，Th17細胞增加，Th17／Treg比率明顯增高。Lee等［4］研究也發現，復發性流產非妊娠女性中IL-17＋T細胞（包括Th17和Tc17細胞）明顯高于對照組，而Foxp3＋，Foxp3low和CD4＋Foxp3＋T細胞明顯降低。

芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一種配體激活轉錄因子，以配體依賴的方式調節Treg／Th17的平衡［6］。AhR高親和力配體主要為環境毒素四氯二苯對二噁英（2，3，7，8-etrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）以及內源性色氨酸衍生物6-甲酰基吲哚并咔唑（6-formylindolo［3，2－b］carbazole，FICZ）。當前者激活初始T細胞中AhR時，T細胞向Treg分化；而當后者激活AhR時，初始T細胞則向Th17分化。AhR在病理妊娠過程中是否發揮作用尚缺乏研究，因此，本研究將分別檢測AhR在原因不明復發性流產患者和正常早孕者蛻膜組織中的表達情況，并分析其與蛻膜中Treg／Th17細胞因子平衡的相關性，從而初步探討其在復發性流產中的作用。

1 對象與方法

1．1 研究對象

選擇2013年1月至9月就診于我院婦產科門診及婦科病房，＜35歲的原因不明自然流產患者23例，作為觀察組。其中，16例發生過1次自然流產，7例發生過2次自然流產。入選標準：男方精液分析正常；月經周期正常，通過婦科檢查、白帶檢查以及超聲檢查等排除器質性疾病、生殖器官畸形及感染性因素；夫婦雙方無家族遺傳病及近親結婚史；無自身免疫性疾病；自身抗體檢查：抗核抗體系列、抗卵巢總抗體、抗子宮內膜總抗體，抗心磷脂抗體、抗精子總抗體、抗雙鏈DNA、抗中性粒細胞質抗體均為陰性；以往未進行過相關免疫治療；無內分泌代謝紊亂性疾病；凝血系列、全血分析均正常。

另選擇同時期在我院婦產科門診手術室行人流術的健康早孕婦女30例，作為對照組。入選標準：＜35歲，妊娠12周以內要求人工流產的健康妊娠婦女；本次妊娠期間無先兆流產癥狀和體征；超聲證實胚胎發育正常；既往無解剖異常、遺傳性疾病、內分泌疾病史，無自然流產、死胎、死產史，無生殖道感染，無自身免疫性疾病史。

兩組年齡與孕周間差異均無統計學意義（P＞0．05）。本研究經本院倫理委員會批準，受試者均知情同意。

1．2 方法

1．2．1 標本收集 無菌操作條件下分別收集兩組蛻膜組織，PBS漂洗后剪取約100 mg，置于DEPC處理過的EP管中，加入1 mL Trizol試劑，于－80℃保存備用。

1．2．2 實時熒光定量PCR法檢測mRNA表達 取出“1．2．1”中的組織，待溶解后，用組織勻漿儀粉碎，Trizol法提取總RNA；Nanodrop 2000分光光度計測定RNA濃度，加入DEPC調節各樣本RNA濃度為500μg／μL備用。用TaKaRa公司反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，于－20℃保存備用。用SYBR Green法進行實時熒光定量PCR。按照Bestar Real-time PCR Master Mix（DBIBioscience，USA）說明書配制反應體系，置入ABIViia7（Applied Biosystems，USA）PCR儀中反應。PCR反應條件：95℃預變性2 min，然后95℃15 s，60℃31 s，共40個循環。每個樣本設3個復孔。用單克隆大腸埃希菌分別稀釋100、1 000、10 000、100 000倍后作為模板配置上述體系后行PCR，用所得Ct值制作標準曲線Y＝a Ct＋b，計算a、b值，分別將各樣本所測Ct值帶入標準曲線計算出相應Y值，依據Y值計算相對表達量（△t）：△t＝Y（檢測基因）－Y（GAPDH），檢測基因mRNA的相對表達量為2－△t。引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。引物序列見表1。

1．3 統計學方法

采用SPSS 17．0軟件進行統計學分析。資料符合正態性分布，采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。采用Pearson相關性分析，相關系數r＞0．5時為相關性良好。

2 結果

2．1 兩組蛻膜中各因子mRNA的表達

觀察組蛻膜中AhR、ROR-γmRNA表達明顯高于對照組，而Foxp3、IL-10 mRNA表達明顯低于對照組（P均＜0．05）。見表2。

2．2 兩組蛻膜中各因子表達量的相關性比較

觀察組和對照組蛻膜中AhR mRNA表達與ROR-γmRNA表達均呈正相關（P均＜0．05），而與Foxp3 mRNA以及IL-10 mRNA表達均無明顯相關性（P均＞0．05）。見圖1。

3 討論

AhR又稱二噁英受體，體內表達水平較低［7－8］，但分布較為廣泛，在肺、肝、腎、胎盤、扁桃體等組織及B淋巴細胞中均有表達。AhR通過介導多環芳烴類的毒性作用，參與某些重要的生物學過程［7，9－10］。AhR與不同配體結合后影響細胞的不同功能，并進一步影響Treg／Th17平衡［11－12］，從而調節機體的免疫狀態。

AhR表達于母胎界面、孕早期胚胎、蛻膜組織和孕前子宮內膜［13］，正常足月分娩胎盤的合體滋養層細胞內也有表達。本研究結果顯示，觀察組蛻膜組織中AhR表達明顯高于對照組，提示AhR高表達可能與原因不明自然流產之間存在聯系。AhR配體可在生殖道和胚胎中聚集，從而增強局部AhR的表達，進而參與各種生理病理過程。本研究中AhR在原因不明自然流產蛻膜組織中表達增高，致使部分具有胚胎毒性的AhR配體發揮更強的作用，影響蛻膜的免疫平衡及胚胎發育，導致病理妊娠。

本研究結果還顯示，觀察組患者蛻膜中Treg因子Foxp3、IL-10的表達明顯低于對照組，而Th17細胞因子ROR-γ的表達明顯高于對照組。不同T細胞中AhR表達也不同［14－15］，Treg中AhR表達遠低于Th17細胞。因此，本文觀察組AhR表達增高可能是由于Th17細胞表達增加所致。此外，本研究結果顯示，AhR表達與ROR-γ表達呈良好的正相關，由此表明，檢測AhR表達水平可間接反映Th17水平，從而評估胚胎存活可能；同時，可通過改變AhR水平治療部分免疫因素的自然流產。但是，AhR與Treg的細胞因子Foxp3和IL-10無明顯相關性，可能由于Treg中AhR表達過低，由此可見，AhR難以用于反應Treg的表達水平。因此，推測AhR可能參與Th17的表達上調，干擾Treg／Th17平衡，進而在母胎面免疫調節中起作用，并影響妊娠結局。復發流產患者AhR表達增加是導致Th17上調的原因，還是Th17表達增加后的一個協同表現，目前尚有待進一步研究。

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Relationship between aryl hydrocarbon receptor and the balance of Treg／Th17 cytokines in unexplained spontaneous abortion

GUO Hong-ling1，XU Fen-juan1，MAO Cai-ping2，ZHUANG Yan-yan2，XIA Fei2
（1．DepartmentofGynaecology，the First People′s Hospital of TaiCang，Taicang Jiangsu 215400；2．Departmentof Reproductive Medicine，the First Affiliated Hospital of Suzhou University，Suzhou Jiangsu 215006，China）

Objective：To investigate the expression of aryl hydrocarbon receptor（AhR）in decidua of unexplained spontaneous abortion，and explore the correlation with T regulatory cell（Treg）／Th17 cytokines balance of decidua．M ethods：Twenty-three unexplained recurrent spontaneous abortion women were set as the abortion group，while 30 normal early pregnantwomen as the control group．Quantitative real-time PCR were employed to detect the expression of AhR，forkhead box p3（Foxp3），IL-10 and retinoic acid receptor-related orphan receptorsγ（ROR-γ）mRNA in decidua．The correlation of AhR mRNA with Foxp3，IL-10，ROR-γmRNA were analyzed．Results：The expression of AhR mRNA and ROR-γmRNA in decidua in abortion group was significantly higher than that in control group，while Foxp3 mRNA and IL-10 mRNA expression was significantly lower than the control group（both P＜0．05）．AhRmRNA expression was positively correlated with the level of ROR-γmRNA in two groups（P＜0．05）．However，AhR mRNA expression was not correlated with Foxp3 nor IL-10 mRNA expression in both two groups（both P＞0．05）．Conclusion：In decidua of unexplained spontaneous abortion，Th17 cytokines expression and AhR mRNA expression was increased，with Treg cytokines expression and the ratio of Treg／Th17 decreased，which indicated increasing AhR expression positively correlated with up-regulating Th17 cytokines．

spontaneous abortion；aryl hydrocarbon receptor；T regulatory cell；Th17

郭紅玲（1968—），女，江蘇揚州人，主任醫師，碩士，主要從事復發性流產的研究；夏飛（通訊作者），主任醫師，副教授，E-mail：feix0513＠126．com

R714．21

A

1671－7783（2014）05－0416－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140111

江蘇省衛生廳課題資助項目（H201311）；蘇州市臨床重點病種診療技術專項項目（LCZX201302）

2014－04－21 ［編輯］ 劉星星