運動疲勞可能通過激活海馬小膠質細胞介導的神經炎癥降低大鼠學習記憶功能

孫麗娜，劉曉莉，喬德才

運動疲勞可能通過激活海馬小膠質細胞介導的神經炎癥降低大鼠學習記憶功能

孫麗娜1，2，劉曉莉2，喬德才2

目的：觀察反復力竭運動對大鼠海馬小膠質細胞形態及炎癥因子白介素-1β（interleukin 1 beta，簡稱IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis fatctor-alpha，簡稱TNF-α）和誘導型一氧化氮合酶（inducer type Nitric-Oxide Synthase，簡稱iNOS）表達的影響。方法：雄性SD大鼠隨機分為對照組（CG）和運動疲勞組（EG），CG大鼠常規飼養不進行跑臺運動，EG大鼠進行反復7天遞增負荷的力竭跑臺運動。采用免疫組化方法觀察大鼠海馬小膠質細胞形態和激活水平，通過半定量PCR技術檢測海馬組織IL-1β、TNF-α及iNOS mRNA的表達，并使用Y迷宮主動回避行為學檢測學習和記憶能力。結果：與CG相比，EG大鼠海馬小膠質細胞體積較大、胞體變圓、突起增多并且染色變深，統計學分析陽性細胞面積和染色消減灰度值均顯著高于CG（P<0.05，P<0.01），IL-1β、TNF-α及iNOS mRNA的表達水平也顯著性高于CG（P<0.01），并且EG大鼠學習記憶能力較CG大鼠顯下降（P<0.05，P<0.01）。結論：反復力竭運動后，大鼠海馬小膠質細胞處于激活狀態，海馬內炎癥因子釋放增多，并伴隨有學習記憶能力的下降。提示：運動疲勞所致海馬小膠質細胞的大量激活可能是引發神經炎癥反應，進而降低大鼠學習記憶能力的重要因素之一。

小膠質細胞；運動疲勞；海馬；炎癥反應；學習記憶功能

運動應激所致的神經炎癥反應是否在中樞疲勞的神經調控中發揮作用還鮮有報導。小膠質細胞（microglia，簡稱MG）是中樞神經系統中固有的免疫細胞，是神經炎癥反應的重要參與者。正常情況下，MG處于靜息狀態，形態呈分枝狀，胞體小且數量少；當機體受到應激刺激后，MG處于激活狀態，形態呈“阿米巴樣”，胞體變大、變圓，出現細胞增值、聚集等特征[1]，并顯著上調多種促炎性細胞因子的分泌，在神經炎癥反應中發揮重要作用[2]。海馬是介導應激的重要腦區，也是參與學習記憶的主要核團。實驗室前期研究發現，運動疲勞后海馬CA1區突觸長時程（long-termpotentiation，簡稱LTP）抑制以及神經元電活動的改變可能是導致大鼠學習記憶能力下降的重要原因[3-4]。近期的神經病理學研究表明，由海馬MG激活介導的神經炎癥反應是抑制LTP誘導，降低學習記憶功能的主要原因。由此推測，運動應激時可能也存在由海馬免疫細胞活化介導的神經炎癥反應，從而損害學習記憶功能。為此，本實驗通過建立大鼠反復力竭運動模型，觀察運動疲勞后海馬區MG的形態學改變以及IL-1β、TNF-α和iNOS的表達變化，并同時檢測大鼠學習記憶能力的改變，揭示海馬區MG活化介導的免疫炎癥反應是否參與了運動疲勞后學習記憶能力下降的神經生物學調控過程。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗選擇清潔級健康雄性SD大鼠，體重（200±20）g，購自北京大學實驗動物中心（許可證號：SCXK（京）2006-2008）。動物常規分籠飼養、自然光照、自由攝食和飲水，室溫（20±3）℃，相對濕度40%～60%。適應性飼養2天后，將大鼠隨機分為對照組（control group，簡稱CG）和運動組（exercise group，簡稱EG），每組18只。其中，有6只用于MG免疫組織化學染色，6只用于半定量PCR檢測，另外6只用于Y迷宮主動回避實驗。

1.2 運動疲勞模型的建立

本實驗采用3級遞增負荷跑臺運動方案。動物先進行3天適應性跑臺訓練，從第4天開始正式跑臺運動，負荷分為3級，每級跑速分別為8.2、15、20 m/min，第1、2級分別運動15 min，第3級運動直至大鼠無法維持跑臺預定跑速，滯留于跑道后端3次以上，使用聲波和光、電刺激驅趕仍無效，并伴有呼吸急促，腹臥跑臺等行為表現[4]，運動周期為7天。對照組動物相同條件下常規飼養，不進行跑臺運動。

1.3 Y迷宮主動回避實驗

先將大鼠放在起步區無電刺激下適應3～5 min后通電電擊，規定大鼠被電擊后10 s從起步區直接逃至安全區為一次“正確反應”，若10 s后沒有逃至安全區且仍在起步區為“主動回避錯誤”，10 s后逃離起步區但未到達安全區為“辨別錯誤”。每只大鼠被連續刺激20次，正確率90%作為學會標準（即連續20次電擊中18次正確逃離），達標后立即停止訓練。如未達到規定標準，l min后大鼠進行下一個20次訓練，如此反復訓練直到達標。記錄其訓練中出現的錯誤反應次數和訓練時間作為大鼠學習能力的評定指標。學習測試結束24 h后，再用同樣方法測試大鼠的記憶能力，觀察并記錄大鼠20次電擊過程中的正確次數作為其記憶能力的評定指標。

1.4 小膠質細胞免疫組化染色

大鼠在運動力竭后即刻經水合氯醛麻醉，開胸經左心室灌流生理鹽水200 mL沖洗血液，再用冰冷的4%多聚甲醛灌注5～ 10 min。灌流完畢后立即取腦，置于4%多聚甲醛后固定4 h，隨后將腦轉移到30%蔗糖溶液中直至沉底。切制50 μm厚的冠狀冰凍切片，收集于0.1 mol/L磷酸緩沖液內，按下述步驟進行免疫組織化學染色。切片置于3%H2O2中室溫封閉20 min；3%血清（中杉金橋生物技術有限公司）室溫封閉30 min；一抗（鼠抗OX-42，1：500稀釋，Serotec公司）室溫孵育2 h；二抗（生物素標記的馬抗小鼠IgG，1：500稀釋，中杉金橋生物技術有限公司）室溫孵育2 h，ABC復合物（1：200稀釋，Vector公司）結合反應2 h；DAB顯色劑顯色20 min。然后將切片貼于涂有明膠的載玻片上，脫水透明，加拿大中性樹脂封片。

1.5 半定量PCR

運動組大鼠在運動力竭后即刻斷頭取腦，摳取海馬組織并提取總RNA，以oligo（dT）18為引物反轉錄為cDNA。根據基因庫已知序列設計IL-1β、TNF-α、iNOS和β-actin基因設計引物，引物序列見表1。每個樣本重復測定3次，用同一樣品中β-actin的含量進行校正得到其相對值。

表1 半定量PCR目的基因和β-actin測試所用引物序列表Table1 The Primer sequence table of target gene and β-actin for semi-quantitative RT-PCR

1.6 圖像采集及數據分析

光學顯微鏡下觀察不同組別大鼠MG免疫組織化學腦片，采集圖片并使用Image Pro Analysis Software（Media Cybernetics公司）軟件進行MG陽性染色觀察分析。將各樣本PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用凝膠定量分析軟件Quantity One version 4.3.1（Bio-Rad公司）進行圖片處理，所得數據用平均數±標準誤（Mean±SD）表示。應用SPSS16.0軟件進行統計學分析，組間差異比較采用獨立樣本T檢驗，P<0.05表示組間有顯著性差異，P<0.01表示組間有極其顯著性差異。

2 結果

2.1 小膠質細胞形態和表達變化

免疫組化結果顯示，MG廣泛分布于各組大鼠腦內，免疫染色呈棕黃色，位于胞質和突起中。安靜狀態下，海馬區MG呈分枝狀，胞體小并且數量少，處于非活化狀態；而在EG大鼠海馬內MG染色變深，體積較大、胞體變圓、突起增多的“阿米巴樣”與SUGAMA等[1]的研究結果一致（見圖1）。EG大鼠海馬區免疫陽性小膠質細胞面積顯著大于CG大鼠（P<0.05），并且EG大鼠陽性細胞染色消減灰度值也顯著高于CG（P<0.01）（見圖2）。

圖1 海馬區小膠質細胞的表達（n=6）Figure1 The expression of microglias cells in hippocampus（n=6）

圖2 海馬區MG陽性細胞面積和染色消減灰度值統計柱狀圖（n=6）Figure2 The statistical histogram of the area and the staining gray level of positive microglia cells in hippocampus（n=6）

2.2 炎癥反應因子的表達變化

半定量PCR結果顯示，運動疲勞后大鼠海馬區IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA的表達水平較對照組均具有極其顯著的統計學意義（P<0.01），3種炎癥因子在EG大鼠海馬區內分泌明顯增多（見圖3）。

圖3 不同組別大鼠海馬組織炎癥因子mRNA的表達變化（n=6）Figure3 The change of expression of inflammation factor mRNA in hippocampus（n=6）

2.3 大鼠學習記憶能力的改變

Y迷宮主動回避測試運動疲勞對大鼠學習能力的影響，其中，反應學習能力的指標，即主動回避錯誤次數、辨別錯誤次數和訓練時間統計結果均為EG大鼠顯著高于CG（P<0.05，P< 0.01）。EG大鼠記憶能力，即記憶正確次數則顯著低于CG（P< 0.01），可見運動疲勞后大鼠的學習和記憶能力均明顯降低（見表2）。

表2 Y迷宮主動回避測試指標（Mean±SD，n=6）Table2 The testing index of Y maze active avoidance（Mean± SD，n=6）

3 討論

電刺激、冷刺激[1-2]等急性刺激可激活腦內的MG已得到證實。在急性應激條件下，內分泌系統中下丘腦—垂體—腎上腺皮質（hypothalamic pituitary adrenal，簡稱HPA）軸的迅速激活，以及交感神經系統活動的增強，是腦內MG活化的重要通路[2]。與急性應激類似，運動應激也可快速激活HPA軸并增強交感神經系統的活動[5]，從而引起下丘腦內去甲腎上腺素（norepinephrine，簡稱NE）分泌的增加，NE可與MG膜上的β-腎上腺素能受體結合，通過第二信使環-磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，簡稱cAMP）將信號傳入細胞核內，啟動IL-1等多種炎癥因子DNA轉錄，從而導致MG活化并合成釋放大量炎癥因子，如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18等。CARMICHAEL等[6]研究發現，運動疲勞引發神經炎性反應與外周炎癥信號激活位于腦連接部位血管周圍的巨噬細胞和腦內皮細胞產生的免疫應答有關。本研究結果也發現，運動疲勞時，腦內免疫細胞MG被大量激活。雖然目前還沒有直接證據表明上調的炎癥因子是否全部由激活狀態的MG分泌，但大量神經病理學研究已證實[1-2，7]，MG激活是腦內炎癥因子分泌增加的主要來源。由此推測，MG可能參與介導了運動疲勞引發的神經炎癥反應過程。

IL-1β和TNF-α是應激時產生的主要促炎因子，其受體廣泛分布于神經元和膠質細胞膜上。2種促炎因子與其受體（IL-1R、TNF-R）結合后，可激活絲裂原激活蛋白激酶類（mitogen-activated protein kinases，簡稱MAPKs）和核內NF-κB通路，啟動IL-6、前列腺素E2、iNOS等炎癥介質的基因轉錄，促進炎癥反應發生[8-9]。目前，由MG激活引起的IL-1β、TNF-α分泌上調所致的腦高級功能的損害越來越受到學者們的關注。本研究發現，運動疲勞可顯著增加炎癥因子IL-1β、TNF-α以及炎癥介質iNOS的分泌，并伴隨學習記憶能力的下降。然而，運動疲勞大鼠海馬腦區內IL-1β、TNF-α和iNOS的上調是否與學習記憶功能下降有關，尚缺乏直接的實驗證據。根據現有的文獻報道，大致可將致炎因子造成學習記憶功能下降的可能機制歸為以下2個方面。（1）腦內上調的IL-1β、TNF-α可與其受體結合，啟動胞內不同的信號通路，最終導致胞內鈣超載，從而抑制LTP誘導。如TNF-α與TNF受體1（TNF-receptor 1，簡稱TNF-R1）結合后，上調α甲基惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，簡稱AMPA）受體的表達，激活由第二信使三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-triphosphate，簡稱IP3）介導的信號通路，引起鈣離子大量內流[10]；IL-1β、TNF-α分別與膜受體IL-1R、TNF-R1和TNF-R2結合，激活Jun氨基末端激酶（jun N-terminal kinase，簡稱JNK）和p38促分裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，簡稱p38 MAPKs）的信號轉導，造成突觸后NMDA受體磷酸化，觸發Ca2+大量內流，引起胞內鈣超載[11-12]；TNF-α與TNF-R1的結合還可激活核內NF-κB通路，啟動iNOS基因的轉錄，引起iNOS表達的增加，促進NO釋放，造成細胞凋亡和胞內Ca2+濃度的升高[9，12]。（2）上調的IL-1β、TNF-α可抑制星形膠質細胞的谷氨酸（glutamate，簡稱Glu）轉運功能，導致胞外Glu濃度升高，與膜上的G蛋白耦聯代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor，簡稱mGluR）結合，激活胞內第二信使IP3，引起胞內Ca2+的大量釋放[12]，也是造成LTP抑制的因素。在本研究的基礎上，今后將從胞內信號轉導通路的角度繼續深入研究神經炎癥反應導致學習記憶功能下降的可能機制，為闡明二者之間的相互關系提供直接的實驗依據。

4 小結

反復力竭運動后，大鼠海馬小膠質細胞處于激活狀態，海馬內炎癥因子IL-1β、TNF-α及iNOS釋放增多，并伴隨有學習記憶能力的下降。提示，海馬腦區MG激活及其介導的神經炎癥反應，可能通過多條信號轉導通路參與了海馬LTP的抑制過程，也是導致運動疲勞后大鼠學習記憶能力下降的重要因素之一。

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Exercise-induced Fatigue May Reduce Learning and Memory Function through Neuroinflammation Mediated byMicrogliaActivationinHippocampus

SUN Lina1，2，LIU Xiaoli2，QIAO Decai2
（1.School of PE，Taiyuan University of Technology，Taiyuan 030024，China；2.School of PE and Sport，Beijing Normal University，Beijing 100875，China）

Objective：To observe the effects of microglia morphology and expression of inflammation factors include interleukin 1 beta（IL-1β），tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）and inducer type Nitric-Oxide Syntheses（iNOS）in SD rat hippocampus after repeated exhaustive exercise.Methods：Male SD rats were randomly divided into control group（CG）and exercise-induced fatigue group（EG）.Seven days of increasing load exercise to build exercise-induced fatigue model，CG group was not intervention.The immunohistochemistry were used to observe the morphological and the activation level of microglia.The expression of IL-1β，TNF-α and iNOS mRNA in hippocampus was detected with semi-quantitative RT-PCR，and the Y maze active avoidance behavior were used to detect the learning and memory ability.Results：Compared with CG group，the volume of microglia cells was larger，the soma became round，the protuberance was increased and the stained was darker.Statistical analysis that the area of positive cells and the staining gray level were significantly higher than in control group（P<0.05，P<0.01），while the expression of IL-1β，TNF-α and iNOS mRNA was also significantly higher than the control group（P<0.01）. And the learning and memory ability of rats in exercise-induced fatigue group was significantly lower than the control group（P<0.05，P<0.01）.Conclusions：After repeated exhaustive exercise，the microglia cells were activated，inflammation factors in rat hippocampus were increased and the learning and memory ability of rat was declined.The results indicate that the microglia activation caused by exercise-induced fatigue may induce neuroinflammation and it might be one of the important factors leading to the decline of learning and memory ability in rats.

microglia；exercise-induced fatigue；hippocampus；inflammation；the function of learning and memory

G 804.2

A

1005-0000（2014）03-190-04

2013-12-10；

2014-03-05；錄用日期：2014-03-06

國家自然科學基金項目（項目編號：31171138）

孫麗娜(1980-)，女，山西大同人，博士,講師，研究方向為運動與神經調控；通信作者：喬德才（1957-），男，教授，博士，研究方向為運動與神經調控。

1.太原理工大學體育學院，山西太原 030024；2.北京師范大學體育與運動學院，北京 100875。