牡丹組織培養技術研究綜述

劉 磊，王志勇

（信陽農林學院園藝系，河南 信陽 464000）

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）為毛茛科芍藥屬落葉小灌木，原產中國，它雍容華貴，嬌艷嫵媚，花形大而美，被譽為“花中之王”。牡丹傳統的繁殖方法多采用播種、嫁接和分株方式，不僅成苗周期長，而且出苗量少，質量參差不齊。組織培養在牡丹的快速繁殖方面具有無可比擬的優勢［1～2］，通過組織培養技術解決牡丹常規繁殖中存在的不足，是牡丹商品化、產業化發展的必然趨勢，也是加快牡丹育種和繁殖步伐的重要途徑。

1 研究進展

1.1 外植體類型

1.1.1 胚 胚培養技術是指將植物的種胚接種在無菌的條件下培養，使之生長發育成幼苗的技術，既可以用來克服胚敗育和發育不良，也可以縮短種子休眠期，促進萌發，提高萌發率。在自然界中，牡丹種子的休眠期長達數年，采用胚培養時可縮短至28～42 d。

培養基對離體胚的生長有著重要影響。周仁超等以‘紫斑牡丹’為材料進行胚培養，結果種胚在1/2MS+BA 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L的培養基上可較快生長并分化出不定芽；不定芽在1/2MS+BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L的培養基上可快速繁殖，平均增殖倍數達6.5［3］。楊紅超在牡丹種胚培養時發現，在培養基中添加胚乳的水提液對胚根和子葉生長有一定的抑制作用［4］。安佰義以胚為材料考察了不同培養基對叢生芽誘導的影響，結果WPM培養基叢生芽誘導率最高，為36.66%，較MS培養基的叢生芽誘導率提高6.66百分點；B5培養基叢生芽誘導率最低，為20.00%；MS培養基誘導出芽的總數最多，芽高、葉色正常，但平均叢生芽數較少；WPM培養基誘導出芽的總數少，芽矮，但平均叢生芽數較多；B5培養基誘導出的芽不僅總數、平均叢生芽數少，而且生長異常。另外，胚的不同發育時期對其培養結果有顯著的影響［5］。Brukhin V B和Batygina T B研究發現，只有選擇球狀胚階段后的胚狀體培養，才能增加繁殖能力，取自成熟種子的胚，在無激素MS和1/2MS培養基上培養均能形成正常小植株；而早期魚雷形胚和心形胚在培養后只有25%能形成小植株；在愈傷組織誘導培養基中培養21 d后，心形胚、魚雷形胚、成熟種胚的愈傷誘導率分別為60%、80%、100%［6］。

1.1.2 花藥和花粉 牡丹花藥、花粉的培養條件為花藥處于有絲分裂的第一階段，基本培養基中不加任何生長調節物質，培養溫度為25～30℃，從花藥中誘導出胚狀體需120～160 d，而且胚狀體的生長速度很慢［7］。Shoyama Y等成功地進行了P.suff ruticosa和P.lutea Superba兩個品種的花藥離體培養，所用培養基是LS+3%蔗糖+500 mg/LCH+1mg/Lkin+1 mg/L IAA，培養21d后可看到多細胞和多核花粉粒；培養42 d后，2%～3%的花粉粒形成了多細胞胚狀體［8］。Roberts和Sunderland用不加碳和瓊脂的MS培養基進行液體培養，接種花藥密度為1～2個/mL獲得成功［9］。

1.1.3 鱗芽 鱗芽培養被認為是牡丹組織培養中最有應用價值的途徑之一，關于鱗芽組織培養的報道很多，但是鱗芽的整個再生體系尚未建立，關鍵原因在于鱗芽生根十分困難。張桂花等利用牡丹腋芽和頂芽進行組織培養，獲得了沒有生根的試管苗植株［10］。徐桂娟以‘鳳丹’、‘海云紫’等品種為材料，以改良MS培養基作為基本培養基也成功地得到了再生植株［11］。2003年，李艷敏用‘青龍臥墨池’、‘銀粉金鱗’、‘紫瑤臺’3個牡丹品種的鱗芽進行組織培養，獲得再生植株并移栽成功［12］。鱗芽的取材部位不同，誘導的難易程度也不同，在所有鱗芽中，以土芽的分化表現最好，分化率可達94%；腋芽次之，為71%；花芽最差，僅為16%［13］。陳笑蕾在誘導‘洛陽紅’、‘胡紅’、‘肉芙蓉’、‘魯荷紅’、‘烏龍捧盛’、‘朱砂壘’6個牡丹品種增殖時，發現不同品種間的增殖率存在顯著差異，從大到小依次為‘烏龍捧盛’、‘魯荷紅’、‘胡紅’、‘洛陽紅’、‘朱砂壘’、‘肉芙蓉’［14］。

1.2 培養條件和培養基

1.2.1 培養條件 在牡丹組織培養過程中，溫度、光照、濕度和pH等環境因子是組織培養中重要的影響因素。研究認為，牡丹組織培養的最佳溫度為（25±1）℃，光照強度為1 500～2 000 Lx，光照時數為10～12 h/d，pH為5.8～6.0［5，15］。此外，在培養過程中應注意對晝夜溫差的控制，晝夜無溫差將導致干物質積累量、葉綠素含量減少、酶功能失調、蛋白質含量降低，從而導致玻璃化苗產生。通過變溫處理，加大晝夜溫差會使玻璃化現象消失［16］。在濕度控制方面，一般認為采用通透性較好的棉塞等封口材料有利于培養材料光合干物質積累，降低濕度，減少玻璃化苗的發生［17］。張桂花通過對牡丹品種‘金星雪浪’的研究發現，牡丹試管苗在20～22℃條件下葉片微綠，生長緩慢，個別出現玻璃化苗；在24～26℃條件下，葉片濃綠，苗健壯且生長速度較快；大于26℃，葉片黃化，苗弱，生長速度較慢甚至停止生長。光照時數低于8 h/d，試管苗表現正常，生長緩慢；光照時數為10 h/d時，試管苗長勢壯、生長快、芽分化多；光照時數高于12 h/d時，試管苗生長勢弱，個別出現玻璃化苗。光照強度為2 000 Lx時，試管苗生長表現最佳［10］。

1.2.2 培養基 在牡丹組織培養中，供試品種及其外植體類型不同，選用基本培養基則不同。在已報道的牡丹組織培養研究中，大多數學者將MS或1/2MS作為基本培養基［18～21］，但也有一些用WPM作基本培養基［5］。安佰義用經過40 d低溫層積處理后的種胚作為外植體，分別接種于WPM、MS、B5培養基，培養50 d后，不同培養基上叢生芽誘導率存在一定差異。WPM培養基中叢生芽誘導率最高，為36.66%，比MS培養基高6.66百分點；B5培養基最低，為20.00%，比MS培養基低10.00百分點［5］。何桂梅以自然授粉約90 d的‘紫斑牡丹’和‘楊山牡丹’近成熟胚作為外植體，接種于MS、1/2MS、1/2MS+Vc100 mg/L培養基中，發現3種培養基上種胚的生長表現相似，均呈增大的趨勢，形成蓮座狀苗。MS培養基中少數種胚真葉淺綠色，1/2MS培養基添加Vc 100 mg/L后反而降低了種胚的抽真葉率及生根、成苗率，綜合考慮種胚的各種生長指標，認為1/2MS培養基可作為牡丹近成熟胚的基本培養基［22］。

1.3 生根培養

組培苗的生根過程是一個復雜的生理生化過程，一般影響組培苗生根的因素有植物材料、培養基類型［23］、植物生長調節劑、糖和其它因子［24］。在牡丹無根苗生根培養階段常使用的生長調節劑為IBA，根據IBA的使用方式不同，其生根方法分為一步生根法（在含有低濃度IBA培養基上連續培養）、速蘸法（將微插條基部在一定濃度IBA溶液中浸泡一定時間，然后將其轉接到含有活性炭而不含植物生長調節劑的培養基中［1］）、兩步生根法（先在根誘導培養基上進行短期誘導培養，然后轉移至不含植物生長調節劑的培養基中讓根系發育），先采用根誘導再進行根形成的兩步連續生根法培養是最有效的生根方法［25］。試管苗瓶外生根技術是近幾年研究成功的一項先進生根技術，該技術的關鍵是將試管苗生根和馴化結合起來，從而省去用來提供營養物質和支撐作用的培養基，簡化組培程序，降低生產成本，提高繁殖系數，進而解決了組培工廠化育苗生根難的問題［26～27］。

1.4 組培苗的移栽馴化

牡丹移栽成活率低是限制組培快繁技術應用于生產及育種研究的關鍵因子之一。雖然幼苗生根質量高及生長健壯為移栽馴化成活奠定了良好的物質基礎，但適宜的煉苗移栽方法、上盆時間、栽培基質、環境及移栽后的溫濕調控與管理手段也是影響幼苗成活的重要技術環節。李玉龍在牡丹試管苗誘導出根1條，長到3～4 cm時進行煉苗，將瓶塞打開放在陽光充足處通風透光煉苗3～4 d后移栽，效果較好［28］。孔祥生認為以腐殖土做基質移栽幼苗比蛭石作基質移栽幼苗成活率高，且移栽苗生長健壯［29］。李志軍等在保持20℃左右的溫度條件下，通過蛭石+草炭土（1∶1）和泥炭+珍珠巖（1∶1）兩種基質對生根苗移栽影響的研究表明，兩者對移栽成活率的影響差異不顯著，但對幼苗后期生長速率有一定的影響，移栽30 d后，幼苗平均高分別為18.4、11.5 cm，因此認為蛭石+草炭土（1∶1）基質更適宜幼苗生長［30］。

2 存在的問題

2.1 污染

組培苗培養過程中造成污染的因素很多，如工作環境、培養基及器皿消毒不徹底、外植體帶菌、工作人員操作不規范等。造成污染的病原主要分為細菌和真菌兩大類，細菌污染的特點是菌斑呈黏液狀，且在接種1～3 d后即可被發現；真菌污染的特點是污染部分長有不同顏色的霉菌，在接種3～15 d后才出現癥狀［31］。常用的消毒劑有升汞、次氯酸鈉、雙氧水等［32］。

2.2 褐化

牡丹為木本植物，次生代謝旺盛，植物體內含有較多的酚類化合物，組織培養過程中外植體極易褐化，這些褐色物質在培養基中不斷擴散，抑制其它酶的活性，毒害培養材料，嚴重影響組培苗的成活率、擴繁率。在牡丹組培中對褐化的控制不容忽視，最常用的方法是在培養基中添加防褐劑。好的防褐劑既能有效控制褐化現象的發生，又能促進繁殖材料的生長和增殖［33］。

2.3 玻璃化

所謂玻璃化，是指在離體培養中，組織莖芽逐漸變為半透明狀畸形植株，這種植株難以移栽成活，嚴重制約著繁殖效率。在牡丹離體培養中，由于生長調節物質、光照、溫度的不適宜，經常可以觀察到玻璃化現象。

2.4 組培苗生根難度大

主要表現在生根率不高，一些品種難以獲得生根苗；生根質量差，部分不定根由愈傷組織產生，使根與莖中間形成離層，缺乏疏導組織聯系，且不定根易脫落，影響移栽成活［34］。因此，誘導帶有高質量根系的試管苗是凾待解決的問題。

2.5 移栽成活率低

一是組培苗在移栽過程中容易斷根，二是組培苗移栽階段感病嚴重而加大死亡率。因此要不斷提高不定根質量和組培苗適應環境的能力，提高移栽成活率，才能為實現牡丹商品化、產業化發展奠定基礎。

3 今后的研究方向

隨著組織培養技術的迅猛發展，離體快繁技術在繼續發揮傳統優勢。針對牡丹組培生產中存在的問題，應不斷加強牡丹品種組織培養的技術體系研究，研制出針對不同品種的高效、實用、標準組培快繁體系。同時利用現代生物技術進一步拓寬研究領域，如利用轉基因技術在分子水平上改良牡丹的特定性狀，以提高其抗逆性［35］，擴大園林綠化的應用范圍；改變花色［36］，延長盛花期［37～38］，篩選優良切花品種；矮化植株和縮短根長，實現牡丹由田間栽培到室內培養的轉變。在牡丹藥用品種研究方面，通過RNAi技術，調控其代謝途徑，提高牡丹根皮中有效成分的含量。還應采用發根農桿菌誘導牡丹發狀根，提高其生根率。

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