銅綠假單胞菌外膜蛋白D2與亞胺培南耐藥關系的研究＊

閆玉蘭，郭世輝，李 萌，吳曉寧，梁宏潔（廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科，南寧 530021）

銅綠假單胞菌是臨床常見的條件致病菌，常對多種抗菌藥物天然耐藥，碳青霉烯類藥物[亞胺培南、美羅培南等]是臨床用于治療銅綠假單胞菌感染的常用抗菌藥物。然而，隨著碳青霉烯類藥物在臨床上的廣泛應用，銅綠假單胞菌對此類藥物的耐藥率也明顯升高。有文獻報道銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥主要是由胞壁屏障機制所致，由碳青霉烯酶所致的耐藥只占極少部分[1]。現將廣西地區銅綠假單胞菌中外膜蛋白D2（OprD2）的缺失與亞胺培南耐藥之間的關系分析報道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 選擇2011年6月至2012年12月廣西醫科大學第一附屬醫院各科住院患者的各類臨床標本。同一患者分離得到的菌株不重復計入。質控標準株ATCC27853由衛生部臨床檢驗中心提供。

1.2 主要試劑 水解酪蛋白（MH）瓊脂粉（杭州天和微生物試劑有限公司）；抗菌藥物亞胺培南粉劑（美國默沙東制藥公司）；細菌膜蛋白提取試劑盒購于上海炎彬公司，蛋白marker購于TaKaRa公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天公司，考馬斯亮藍快速染色液購于上海雙螺旋生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 VITEK 2和ATB鑒定儀（法國梅里埃公司），MINI垂直電泳槽、恒壓恒流電泳儀、凝膠成像分析儀（Bio－Rad公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌株鑒定 用梅里埃的VITEK－2和ATB鑒定儀進行鑒定。

1.4.2 耐藥菌株的篩選 參考美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）2012年標準，用瓊脂平皿二倍稀釋法測定銅綠假單胞菌對亞胺培南的最小抑菌濃度（MIC）值，MIC≥8為耐藥。

1.4.3 水楊酸鹽抑制實驗[2－3]將對亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌株分別接種于含有和不含32mmol／L水楊酸鈉的MH平板上，再將亞胺培南藥敏紙片分別貼在兩個平板上，將平板置于37℃培養箱中培養18～24h，觀察亞胺培南抑菌圈的大小。

1.4.4 外膜蛋白的提取與制備 根據試劑盒里的說明書提取細菌的膜蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白配制成5.0mg／mL的濃度，并于－80℃儲存備用。

1.4.5 蛋白質電泳 將蛋白樣品與樣品緩沖液以4∶1的比例混勻，100℃加熱5min以使蛋白質變性。通過SDS－PAGE電泳（分離膠濃度為10%）分離外膜蛋白，電泳時濃縮膠的電壓為80V，分離膠的電壓為120V。然后用考馬斯亮藍快速染液染色、脫色，并用凝膠成像系統成像。

1.4.6 外膜蛋白位置的確定 將上述在含和不含32mmol／L水楊酸鈉的MH平板上生長的對亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌分別轉種到肉湯培養基中，水浴震蕩過夜。提取細菌的外膜蛋白并SDS－PAGE電泳。利用銅綠假單胞菌OprD2能被水楊酸鹽抑制的特性[4]以確定外膜蛋白的位置。

2 結 果

2.1 銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥情況 共檢出亞胺培南耐藥株106株，其對亞胺培南的MIC值均大于或等于16μg／mL；30株亞胺培南敏感株的MIC值均小于或等于2μg／mL。

2.2 水楊酸鹽抑制實驗結果 對亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌，在含32mmol／L水楊酸鈉的MH平板上生長，亞胺培南抑菌圈直徑小于或等于12mm，即對亞胺培南耐藥；而在不含水楊酸鈉MH平板上生長的亞胺培南的抑菌圈直徑大于25mm，即對亞胺培南敏感。

2.3 外膜蛋白位置的確定 在含水楊酸鈉平板上生長的菌株不表達OprD2（即OprD2蛋白缺失），生長在不含水楊酸鈉平板上的菌株則表達OprD2蛋白（即OprD2蛋白不缺失），可由此確定銅綠假單胞菌的OprD2的位置。

2.4 SDS－PAGE凝膠電泳結果 銅綠假單胞菌ATCC27853及亞胺培南敏感株均在45×103處出現了OprD2蛋白條帶，在106株亞胺培南耐藥菌中，有99株在45×103處未出現OprD2蛋白條帶，缺失率為86.8%，其余7株亞胺培南耐藥株未出現OprD2的缺失。

3 討 論

銅綠假單胞菌細胞壁兩側有內、外兩層膜，其外膜蛋白本身的通透性不高，缺乏其他多數革蘭陰性菌具有的“典型”高通透性孔蛋白，僅存在著低通透性微孔蛋白形成的小孔道，只允許小分子親水性物質跨膜擴散，對進入菌體的藥物具有選擇性，因此外膜結構在抗菌藥物耐藥中擔任重要的角色[4]。銅綠假單胞菌有多種外膜蛋白，其中OprC（70×103）、OprD2（45×103）、OprE（43×103）均有孔道活性，其中外膜孔蛋白OprD2孔道被認為是小分子碳青霉烯類藥物選擇性快速進入菌體的特異性通道[5]。

以亞胺培南為代表的碳青霉烯類藥物是目前臨床用于治療銅綠假單胞菌感染應用最廣也是效果最好的藥物之一，亞胺培南藥物是以細菌內膜上的青霉素結合蛋白PBP－2及PBP－3為作用靶位的，但藥物必須要通過細菌的外膜才能到達作用靶位，而OprD2是亞胺培南進入細菌的特異性通道[6]，編碼OprD2的結構基因OprD位于染色體上，編碼基因OprD的突變可使OprD2蛋白表達減少甚至缺失，所以當OprD2缺失或表達減少時可導致菌體外膜通透性改變從而使得碳青霉烯類藥物進入菌體受到阻礙，在臨床上表現為銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥。除此以外，OprD2還能形成碳青霉烯類藥物特異性結合位點，是目前所知的銅綠假單胞菌中唯一有助于抗菌藥物通過的孔道蛋白[7]。因此，外膜蛋白OprD2缺失是介導銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要機制之一[8]。而β－內酰胺類抗菌藥物如青霉素或頭孢菌素的作用機制是通過抑制胞壁黏肽合成酶，即青霉素結合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），從而阻礙細胞壁黏肽合成，使細菌胞壁缺損，菌體膨脹裂解。多數青霉素類或頭孢菌素類抗菌藥物主要與PBP1和（或）PBPs結合，形成絲狀體和球形體，使細菌發生變形萎縮，逐漸溶解死亡[9]。即β－內酰胺類抗菌藥物如青霉素和頭孢菌素等不能通過OprD2，因此，以亞胺培南為代表的碳青霉烯類藥物與β－內酰胺類藥物無交叉耐藥性[10－11]。

本次研究發現，106株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌中，99株OprD2缺失，缺失率為86.8%，由此可推斷OprD2的缺失在介導本院銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥中起著重要的作用。其余7株亞胺培南耐藥株未出現OprD2的缺失，說明介導銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的還有其他的機制，如產生β－內酰胺酶[12]、主動外排泵的存在等[13－14]。本次研究中，OprD2的缺失率為86.8%，這與顏英俊等[15]對34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌臨床標本用PCR方法擴增OprD基因并對擴增產物進行DNA分析后發現，對亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌的OprD基因突變率達高92.3%的研究結果相似。顏英俊等的研究還發現OprD基因突變的方式主要有點突變、缺失突變以及插入突變等。細菌因發生基因突變而引起OprD莖環結構L2、L3和亞胺培南藥物主要結合位點氨基酸發生替換和移位突變，最終導致銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥[16]。國外也有與顏英俊類似的報道，如Yoneyama等[17]研究發現，OprD2基因缺失存在缺失突變，編碼區DNA片段發生缺失，導致移位突變，并形成1個位置提前的新終止密碼子進而引起其肽鏈異常，最終導致銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥[18]。這說明OprD2的缺失是導致銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥的重要機制之一。

本研究OprD2缺失率為86.8%，而2010年哈爾濱地區的OprD2缺失率為26.19%（42株耐亞胺培南菌株中11株完全缺失）[11]，2007年北京一所醫院的OprD2缺失率為56.10%[19]，這與本研究的OprD2缺失率有差異，可能是地區不同而導致的差異或研究的年份不同而導致的差異。本研究只是針對廣西地區耐亞胺培南的銅綠假單胞菌進行耐藥機制的研究，對OprD2的缺失僅作了定性分析，OprD2的表達量與銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥程度之間的關系有待作進一步研究。

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