根管封閉劑生物安全性評價方法及其應用的研究進展

樸維英,陳 路,王成坤

(吉林大學口腔醫院牙體牙髓病科,吉林長春 130041)

根管封閉劑生物安全性評價方法及其應用的研究進展

Progress research on evaluation methods of biological safety and application of root canal sealer

樸維英,陳 路,王成坤

(吉林大學口腔醫院牙體牙髓病科,吉林長春 130041)

根管封閉劑臨床應用前應進行生物安全性評價,客觀檢驗和評價根管封閉劑的生物安全性、選擇生物相容性高的材料應用于臨床一直是牙體牙髓病學領域的研究熱點。本文對根管封閉劑生物安全評價的必要性及其常用實驗細胞和實驗方法進行綜述。

根管封閉劑;生物安全性;細胞實驗

研究[1]證明:根管封閉劑的溶解產物能以半抗原的形式對根尖周組織產生影響,最終導致根管治療的失敗。臨床應用的根管封閉劑種類繁多,旨在通過改變理化性質和充填方式提高根管封閉性能。但是,近年來隨著根充后疼痛的不斷出現,根管封閉劑臨床應用前的生物安全性評價受到人們的高度關注。體外細胞毒性實驗是根管充填材料生物學評價的篩選實驗之一[2]。當前,有關細胞毒性的定義尚無定論,一些學者將其等同于體外毒理,更多學者將其定義為外界毒物所致細胞數量的改變[3]。本文作者采用后一種觀念,就根管封閉劑生物安全性評價的必要性及細胞毒性實驗的相關內容進行綜述。

1 生物安全性評價的必要性

根管充填的目的是通過嚴密的充填將機械及化學預備未能清除的細菌隔絕在根管系統內,同時阻斷根尖周的細菌進入根管,防止其再感染[4]。因此,近年來出現很多旨在提高根管封閉性能的根管充填材料,如環氧樹脂類根管封閉劑EZ-Fill,其特殊的雙向螺旋輸送器可將封閉劑甩入側副根管內,以求達到根尖3 mm良好的封閉[5];硅酮類根管封閉劑Roeko Seal利用自身良好的流動性和固化后0.2%體積膨脹達到根管封閉的效果[6]。

迄今為止,應用最廣的充填材料為馬來膠,其具有輕微的抗菌性能和一定程度的組織刺激性。Cardoso等[7]發現:將馬來膠植入Wistar大鼠皮下,8和60 d組大鼠均出現輕微的炎癥反應,這可能與其高含量的氧化鋅有關。常用的根管封閉劑有氧化鋅丁香油水門汀類、氫氧化鈣類、玻璃離子類和樹脂類。氧化鋅丁香油糊劑(ZOE)雖然有抑菌、安撫和麻醉的作用,但與牙膠、根管牙本質無粘接性,與水反應溶解出Zn2＋,根管封閉性能差[8]。此外,已經證實該類根管封閉劑固化后釋放甲醛,細胞毒性較大[9],且毒性呈劑量依賴性,隨著丁香油量的增加毒性增加,延緩根尖周組織病變愈合甚至再次引發根尖周組織病變[10]。基于以上不足,ZOE已逐漸退出主流應用。氫氧化鈣類根管封閉劑具有良好的生物相容性,可促進根尖周骨質的愈合。但有實驗[11]表明:大量Ca2＋的釋放可引起細胞毒性;且由于氫氧化鈣的電離,導致封閉劑溶解,完整性破壞,根尖封閉性降低[12],故不適合用于成人的永久根管充填,主要用于蓋髓術、根尖誘導成形術和根管消毒等。玻璃離子類根管封閉劑中的玻璃離子與牙體組織羥基磷灰石中的鈣產生化學螯合作用,具有一定的化學粘結性。Ketac Endo是一款可注射型玻璃離子類封閉劑,表面張力低,流動性好,曾于20世紀80年代較多應用于國外臨床。有實驗[13-14]表明:Ketac Endo具有良好的生物相容性,但與牙膠(0.19 Mpa)和牙本質(0.8 Mpa)粘接較弱[15],且持續釋放氟離子,溶解性大,根尖封閉性差[16]。此外,因為尚無玻璃離子的溶劑,根管再治療時難以將其去除,使得這類根管封閉劑使用較少。

目前國內臨床常用的樹脂類根管封閉劑是環氧樹脂類根管封閉劑AH-plus,能與牙本質形成良好的粘結[17],能明顯提高根尖封閉性,但與牙膠尖之間的惰性結合使其無法避免牙膠尖與封閉劑界面的微滲漏。近年來出現了生物陶瓷類根管封閉劑iRoot-SP,被稱為是生物相容性最好的材料。iRoot-SP以生物玻璃為基質,含有硅酸鈣、磷酸鈣、氫氧化鈣和氧化鋯等成分。可與牙本質小管內的水分發生水化反應固化[18],固化過程中有2%～3%的體積膨脹而達到根管系統的3D充填,固化后無體積改變,對牙本質小根管不會產生任何壓應力。但對其細胞毒性的研究報道比較少。

由此可見,目前臨床常用的根管充填材料的性能尚未達到Grossman理想根管充填材料的標準。在臨床操作過程中,根管充填材料可能通過根尖孔及其他通道與牙周和根尖周組織接觸,也可能釋放一些毒性成分,對牙周和根尖周組織甚至全身健康產生影響。部分材料在混合初期,結固的幾小時、幾天或幾周時有毒性,甚至有些材料滲出有害成分長達數年。因此,在臨床應用前,對根管充填材料生物安全性評價的研究十分必要。

2 根管封閉劑生物安全性檢測常用細胞

2.1 實驗細胞種類用于根充材料細胞毒性實驗的細胞分2種:一種是原代細胞系,如牙周成纖維細胞和成骨細胞、牙髓細胞和牙齦成纖維細胞等;另一種是已建株細胞系,如小鼠肺成纖維細胞(L929)、小鼠胚胎成纖維細胞(3T3細胞)及癌細胞等。原代細胞系能較好地模擬口腔狀況,但提取和體外培養過程較復雜,不易培養傳代。有實驗[19]表明:采用消化培養法提取原代細胞時,胰酶消化會損傷細胞,消化時間超過20 min,可消化掉細胞表面的蛋白質,使細胞表面的通透性升高,活力下降。建株細胞系并非口腔細胞,與口腔環境有一定的差異,但容易生長傳代、性質穩定。根據國際標準化組織的要求,已建株細胞作為材料毒性測試的靶細胞,簡單易得、重復性好,且較原代細胞稍敏感,更適合于根管充填材料的細胞毒性實驗,且二者差異對最終材料的毒性分級并無影響。Franz等[20]報道:原代牙齦組織纖維細胞和L929細胞用于細胞毒性實驗,其結果并無較大差異。Huang等[21]用牙周成纖維細胞和V79細胞比較不同種類根充糊劑細胞毒性時發現:總體結果具有一致性且V79細胞更敏感。

2.2 實驗細胞培養MTT實驗細胞培養多采用單層細胞培養法。多層細胞培養方法復雜和難度大,其準確性、可重復性和適用范圍有待于進一步核實。雖然Moharamzadeh 等[22]在檢測樹脂材料細胞毒性時,證實多層細胞培養在評估口腔材料安全性方面較單層細胞能更好地模擬實際環境。但Vajrabhaya等[23]在評估6種根充材料的細胞毒性時發現:多層細胞培養法對于評估根尖周組織無特殊意義。

3 根管封閉劑生物安全性評價常用細胞實驗方法

3.1 同位素標記法同位素標記法包括有鉻釋放法、H3-leucine摻入法、I125-UdR-釋放法和放射性核苷酸前體物摻入法等。該方法能較深入細致地了解細胞受材料毒性影響而產生的分子水平變化,但方法復雜、結果受較多因素影響,且與其他體外法無明顯相關性[24]。

3.2 分子濾過法分子濾過法通過評價材料對單層細胞琥珀酸脫氫酶活性的影響以檢測細胞毒性,用于短期內評價有輕度毒性的材料[25]。該方法可同時觀察材料的原發性及繼發性細胞毒性,快速簡便、敏感可靠,易推廣,但存在強行影響析出產物從材料中擴散的缺點。

3.3 流式細胞術該方法主要針對單一生物材料,分析材料對體外培養細胞生物合成方面的影響。利用鞘流原理,使被熒光標記的單個懸浮細胞排成單列,按重力方向流動。細胞被激光照射后發射熒光,檢測器可逐個對細胞的熒光強度進行測定。根據熒光粒子發出的光量子而定量測定細胞中DNA水平,檢測快捷而方便,便于分析,發展潛力大。

3.4 甲噻唑四唑氮(MTT)比色法MTT是一種黃色可溶性染料。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚顆粒并沉積在細胞中。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,通過測定其吸光度(A)值,可間接反映活細胞數量及細胞代謝活性的強弱。在一定細胞數范圍內(200～5×105),MTT結晶形成的量與細胞數成確定的直線回歸關系[26]。因此可利用A值降低程度反映材料析出液的細胞毒性大小。

國際上評價細胞毒性實驗方法優劣的指標之一是生物學終點及可重復性。MTT法的生物學終點是線粒體,其病變是細胞受損最靈敏的指征,能十分靈敏地反映被測材料對細胞造成的毒性損害程度,且該方法操作簡單,可重復性好,可用于大批量測試。其不足之處是必須使用材料的浸提液進行細胞毒性的測定。Grossman曾提出理想的根充糊劑應不溶于組織液。但大多數根充糊劑在一定程度上是可溶解的[27-28]。有研究[29]顯示:新型根管封閉劑MTA Fillapex和Endosequence BC也有一定的溶解性。因此, MTT法測定根充糊劑的細胞毒性切實可行。

根管封閉劑細胞毒性測定的模塊制作尚無統一標準,采用不同的標準(質量/體積;表面積/體積)將對實驗結果產生影響。為了更好地模擬口腔實際情況,將實驗材料分為2組,即新鮮組和固化組;首先按根充糊劑的產品說明制備糊劑,制作樣本,新鮮組將制備后的糊劑立即置于浸提液中,固化組則靜置一段時間,待材料凝固達到最終的的化學結構后再置于浸提液中;每種根管封閉劑有各自的凝固時間,這樣分組可以測定每種根管封閉不同狀態下的細胞毒性。一些研究[30-31]表明:細胞毒性效應取決于有毒性單體的釋放。對于樹脂類根充糊劑進行根管充填操作時,材料處于不完全聚合狀態,在其聚合過程中很有可能釋放親水性的單體直接導致根尖周組織的損傷。樹脂類材料的聚合不完全,凝固后材料的細胞毒性效應依賴于局部單體的濃度和洗脫動力學。Esteban等[32]比較4種甲基丙烯酸酯類樹脂根充糊劑時發現:新鮮實驗組細胞活性較凝固組差,但組內各材料細胞毒性的大小具有一致性。基于材料本身的理化性質,這種材料處理方式使實驗結果更有說服力、更可信。

值得注意的是:采用浸提液的材料處理方法評價單一實驗材料的細胞毒性時存在結果偏低的不足。Pereda等[33]證實:離子的擴散程度和作用時間呈線性關系,濃度分布隨徑向距離增大而減少。在一定體積的浸提液中,離子濃度達到臨界值后,離子擴散相對停止。就時間依賴性而言,在某一時間點一定體積浸提液中有毒離子濃度是均一穩定的,不再隨時間的變化而改變。而事實上,根充糊劑中的有毒成分會隨著糊劑的溶解不斷釋放到根尖周組織,導致組織損害。液體均一穩定的性質,也無法體現毒性物質導致細胞損傷的徑向依賴性,其忽略了距離材料近的地方毒性物質離子濃度大、細胞毒性也大的事實。但對于多種材料的細胞毒性比較實驗則不存在這一問題,只要組內材料處理方式相同,不會影響實驗數據的總體趨勢,實驗結果是可靠而有意義的。一些根充糊劑細胞毒性比較實驗[10,34-35]均證實:AH-plus細胞毒性較低,生物相容性較好。

綜上所述,任何根充材料均有一定的細胞毒性,根充材料的生物安全性評價十分必要。體外細胞毒性實驗結果可以為臨床應用提供參考依據,盡量選擇細胞毒性小的材料以避免根充術后疼痛的發生和提高治療成功率。體外細胞毒性實驗的方法種類很多,MTT法操作簡單、可重復性好,廣泛應用于細胞毒性測定。在應用中應合理設計,避免干擾因素,降低實驗誤差,以得到可靠的實驗結果。MTT實驗有其自身的局限性,在評價單一根充材料的細胞毒性時,MTT實驗結果只能作為初步判定依據,應結合其他實驗以完善對根管充填材料生物安全性的評價。體外細胞毒性實驗不能完全體現根管充填材料對根尖周組織產生的影響,應用時應進一步考慮其結果與臨床應用的相關性。

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R781.33

A

2014-01-08

吉林省科技廳科技發展計劃項目資助課題(20140414010GH)

樸維英(1987－),女,吉林省磐石縣人,在讀醫學碩士,主要從事牙體牙髓病基礎和臨床方面的研究。

王成坤(Tel:0431-88975348,E-mail:wck1964＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-1123-04

10.13481/j.1671-587x.20140542