SIRT1影響間充質干細胞骨修復的研究進展

王 娜，陳乃耀

(河北聯合大學 附屬醫院 血液內科， 河北 唐山 063000)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有明確的成骨分化能力，且取材方便、來源豐富、免疫原性低，因而被認為是臨床治療骨缺損重要的種子細胞，具有良好的應用前景。盡管如此，間充質干細胞應用過程中還存在著局限性。一方面，MSCs是干細胞家族成員，在體內的數量仍屬少數，在應用之前需進行體外擴增及大規模培養，但是在體外培養過程中，間充質干細胞傳代次數是有限的，因為隨著傳代培養次數的增加，MSCs的增殖減慢甚至停滯、干性減退、喪失分化能力。這些都與細胞衰老的發生密切相關。已知MSCs能夠表達SIRT1，并且隨著代數的增加，該蛋白水平呈下降趨勢[1]。因而，推測 SIRT1在調控間充質干細胞衰老過程中占有重要地位。已有大量研究表明SIRT1可以通過與P53、FOXO、NF-κB及其他蛋白的相互作用去調控細胞衰老。故通過體外活化SIRT1的方式可能會改變MSCs增殖分化的命運。另一方面，炎性反應細胞激活及促炎因子的釋放均會影響MSCs的分化，那么如何改善移植后細胞周圍的炎性反應微環境就顯得頗為重要。目前，大量證據顯示SIRT1能夠顯著抑制炎性細胞激活，減少炎性因子的釋放，從而改善MSCs周圍炎性環境，為間充質干細胞更好地發揮治療作用奠定基礎。目前有關應用SIRT1激活劑白藜蘆醇干預人體新陳代謝，影響骨形成的臨床試驗已有開展并完成(http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=resveratrol+bone&Search=Search)。經試驗證實白藜蘆醇具有抗炎活性，能夠調節人體的糖脂代謝，減少骨量的丟失，促進絕經后女性的骨形成。

1 SIRT1概述

沉默信息調節因子2(silent information regulator 2, Sir2)是生物體內與衰老過程密切相關的蛋白家族成員。SIRT1是存在于哺乳動物體內與Sir2高度同源的同系物，人SIRT1基因定位于染色體10q22.1，基因全長33 kb，包含9個外顯子和8個內顯子。其編碼的蛋白由500個氨基酸組成，相對分子質量120 000，屬Ⅲ型NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶，該蛋白廣泛存在于各種組織細胞之中。SIRT家族共有7個成員，即SIRT 1～7，SIRT1將底物蛋白中賴氨酸的乙酰基轉移到煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的ADP核糖上，產生去乙酰化的蛋白、煙酰胺(NAM)和2’-O-乙酰基-ADP核糖，通過上述反應過程SIRT1參與調節，如細胞衰老、凋亡、分化等多種生理活動，可能是所有生物共同的壽命調節基因之一。研究發現尼克酰胺、sirtinol抑制SIRT1活性，而白藜蘆醇和槲皮素是其功能激活劑。

2 SIRT1抗衰老促進MSCs骨修復

衰老是自然界的普遍現象，從生物學上講，衰老是生物隨著時間的推移發生的退行性改變，表現為結構和機能衰退，適應性和抵抗力減退。衰老是生命發展必然，可以說，任何細胞從誕生之時起，老化的進程就已經開始了，當然間充質干細胞也不例外。在臨床應用MSCs之前，需要進行體外擴增，以期獲得足夠細胞數量用于移植。但體外培養過程，MSCs的衰老使得獲得細胞的質量下降，甚至不具備分化能力，這非常不利于基于MSCs的組織修復過程[2]。為了得到足夠數量的高質量MSCs，必須找到可靠的延緩MSC衰老的方法。目前MSCs衰老的機制尚未完全闡明，主要有以下幾種原因：1)端粒縮短：端粒為真核細胞染色體末端的特殊結構，其在染色體的穩定、復制、保護和控制細胞生長及壽命等諸多方面具有重要作用，并與細胞凋亡和細胞永生密切相關。2)氧化應激：細胞代謝過程中產生的活性自由基會導致脂質過氧化、DNA斷裂突變，修復和復制過程因之發生錯誤，隨著錯誤的積累，產生異常蛋白質，影響原有蛋白和酶的功能，最終導致細胞衰老。MSCs代謝過程中產生的活性氧的積累可以導致減少成骨細胞的數量及骨形成[3]。3)癌基因和抑癌基因：癌基因參與調控細胞周期、DNA損傷修復、凋亡等生理過程，但除此以外，癌基因的激活還涉及細胞衰老過程[4]。

2.1 SIRT1與NF-κB

NF-κB基因家族是哺乳動物中調節衰老相關通路的重要轉錄因子家族，參與細胞對外界刺激的應答，調控與細胞凋亡、細胞衰老、炎性反應發生以及免疫有關基因的活性。在小鼠中發現，應用NF-κB抑制劑可以延緩DNA損傷引發的細胞衰老[5]。而SIRT1可通過將NF-κB亞基去乙酰化調節其活性，從而影響NF-κB下游復雜的信號通路，最終達到調控細胞衰老的目的。

2.2 SIRT1與P53

目前人們普遍認識到P53基因同時參與細胞凋亡、癌變和衰老等的調節[6]。基因水平的研究顯示，過表達SIRT1能夠促進應激狀態下細胞存活[7]，這與其能夠使P53蛋白C端賴氨酸去乙酰化相關。乙酰化的P53能夠促進細胞凋亡的發生[8]。實驗發現，衰老細胞往往高表達P53，SIRT1通過對P53特異性的去乙酰化作用，負性調節其活性[9]。同時這種去乙酰化的P53可以抑制細胞內活性氧的產生[10]，進而改變細胞內氧化還原平衡，最終達到延長細胞壽命的目的。

2.3 SIRT1與FOXO

FOXO亞家族在腫瘤抑制，能量代謝和壽命延長中起著至關重要的作用。有研究表明，SIRT1與FOXO家族相互作用調控細胞衰老[11]。在氧化應激條件下，SIRT1激活劑白藜蘆醇通過與FOXO1、FOXO3a和FOXO4相互作用，降低細胞內活性氧自由基的水平，增強超氧化物歧化酶的生成，提升細胞抗氧化應激能力[12]。

SIRT1通過調控下游信號的去乙酰化作用，進一步影響氧化應激反應和癌基因與抑癌基因的活性，最終改變細胞周期，延長細胞壽命，發揮抗衰老作用，進而實現促進MSCs骨修復作用的目的。然而上述關于SIRT1調控MSCs衰老的機制及促進成骨分化的機制尚不十分清楚，仍需進一步的探討研究。

3 SIRT1抗炎作用與MSCs成骨分化

骨組織修復與重建過程中免疫系統發揮著重要作用[13- 14]，激活的炎性細胞及釋放的炎性因子環境非常不利于骨重建修復。并且近年來越來越多的研究證據表明，促炎因子的釋放抑制MSCs成骨分化[15- 16]。由此可見，炎性反應嚴重影響著基于MSCs的骨修復作用。而SIRT1蛋白在調節炎性反應中發揮著重要作用。

在炎性反應中，激活的巨噬細胞和T淋巴細胞可以產生大量促炎性反應因子，如TNF-α、INF-γ、IL- 6 和IL- 1等。敲除SIRT1可使巨噬細胞釋放TNF-α增多[17]， T細胞更易活化并釋放更多的促炎性反應因子INF-γ和IL- 5等[18]。前面提到SIRT1能夠調節NF-κB活性，NF-κB除參與調節衰老外，還是炎性反應過程中重要的信號分子。SIRT1通過抑制NF-κB活性，減少TNF-α和IL- 1的產生[19]，而促炎因子TNF-α又可以成為NF-κB刺激因子，影響MSCs的成骨分化[20]。根據以上事實，不難發現，SIRT1通過抑制炎性反應細胞功能、減少炎性因子釋放、降低炎性因子效應，實現抑制炎性反應功能，同時也說明SIRT1在免疫調節過程中占有重要地位。

除上述提到的SIRT1對MSCs成骨分化的間接影響外，SIRT1還直接參與調控MSCs的骨向分化過程。經尼克酰胺處理的MSCs更傾向于成脂分化，并且高表達成脂相關轉錄因子PPAR-γ[21]，相反，經白藜蘆醇預處理的MSCs即使培養于尼克酰胺條件下，亦傾向成骨分化，并且PPAR-γ表達下調，成骨相關轉錄因子RUNX2表達增加。另有研究表明，SIRT1還可以促進成骨細胞分化，抑制破骨細胞和骨髓脂肪細胞形成[22]。

4 結語與展望

綜上所述，SIRT1參與調節機體的多種生理功能，并通過這些生理功能直接或間接地影響了MSCs的增殖與分化。目前臨床上基于間充質干細胞的組織修復治療手段已經顯示了良好的前景，但有關SIRT1蛋白與MSCs增殖分化的確切關系尚未解釋清楚。白藜蘆醇雖然是SIRT1的激活劑，但其藥理作用并不僅局限于此，因此其影響MSCs的明確機制還需進一步研究闡釋。SIRT1蛋白與MSCs增殖分化之間有著緊密的聯系，這些發現使得臨床上應用小分子SIRT1激活劑干預MSCs的組織修復過程、更好的調控MSCs向骨及軟骨細胞發育成為可能。

[1] Ho PJ, Yen ML, Tang BC,etal. H2O2accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells [J]. Antioxid Redox Signal, 2013, 18: 1895- 1905.

[2] Alt EU, Senst C, Murthy SN,etal. Aging alters tissue resident mesenchymal stem cell properties [J]. Stem Cell Res, 2012, 8: 215- 225.

[3] Kassem M, Marie PJ. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions [J]. Aging Cell, 2011, 10: 191- 197.

[4] Rufini A, Tucci P, Celardo I,etal. Senescence and aging: the critical roles of p53[J]. Oncogene, 2013, 32: 5129- 5143.

[5] Tilstra JS, Robinson AR, Wang J,etal. NF-κB inhibition delays DNA damade-induced senescence and aging in mice [J]. J Clin Invest, 2012, 122：2601- 2612.

[6] Tucci P. Caloric restriction: is mammalian life extension linked to p53[J]. Aging (Albany NY), 2012, 4: 525- 534.

[7] Lee JT, Gu W. SIRT1 Regulator of p53 Deacetylation[J]. Genes cancer, 2013, 4: 112- 117.

[8] Yuan F, Xie Q, Wu J,etal. MST1 promotes apoptosis through regulating Sirt1-dependent p53 deacetylation[J]. J Biol Chem, 2011, 286: 6940-6945.

[9] Hasty P, Christy BA. P53 as an intervention target for cancer and aging [J]. Pathobiol Aging Age Relat Dis, 2013, 3: doi:10.3402/pba.v3i0.22702.

[10] Radak Z, Koltai E, Taylor AW,etal. Redox-regulating sirtuins in aging, caloric restriction, and exercise[J]. Free Radical Biol Med, 2013, 58: 87- 97.

[11] Fusco S, Maulucci G, Pani G. Sirt1 Def-eating senescence? [J]. Cell Cycle, 2012, 11: 4135- 4146.

[12] Hori YS, Kuno A, Hosoda R,etal. Regulation of FOXOs and p53 by SIRT1 modulators under oxidative stress [J]. PloS ONE, 2013, 8: doi: 10.1371/journal.pone.0073875.

[13] Shi Y, Wei L, Wang Y,etal. Stem cells deployed for bone repair hijacked by T cells[J]. Cell Stem Cell, 2012, 10:6- 8.

[14] Park MJ, Park HS, Cho ML,etal. Transforming growth factor β-transduced mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune arthritis through reciprocal regulation of Treg/Th17 cells and osteoclastogenesis [J] Arthritis Rheum,2011, 63:1668- 1680.

[15] Krum SA, Chang J, Miranda-Carboni G,etal. Novel functions for NF-κB: Inhibition of bone formation [J]. Nat Rev Rheumatol, 2010, 6:607- 611.

[16] Chang J, Wang Z, Tang E,etal. Inhibition of osteoblastic bone formation by nuclear factor kappa B [J]. Nat Med, 2009, 15:682- 689.

[17] Shen Z, Ajmo JM, Rogers CQ,etal. Role of SIRT1 in regulation of LPS-or two ethanol metabolites-induced TNF-α production in cultured macrophage cell lines [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2009, 296: 1047- 1053.

[18] Zhang J, Lee SM, Shannon S,etal. The type III histone deacetylase SIRT1 is essential for maintenance of T cell tolerance in mice [J]. J Clin Invest, 2009, 119:3048- 3058.

[19] Kang J, Jiang MH, Min HJ,etal. IKK-β-mediated cell activation exacerbates inflammation and inhibits recovery after spinal cord injury [J], Eur J Immunol, 2011,41:1266- 1277.

[20] Tang Y, Xie H, Chen J,etal. Activated NF-κB in bone marrow mesenchymal stem cells from systemic lupus erythematosus patients inhibits osteogenic differentiation through downregulating Smad signaling [J] Stem Cells Dev,2013, 22:668- 678.

[21] Shakibaei M, Shayan P, Busch F,etal. Resveratrol Mediated Modulation of Sirt- 1/Runx2 Promotes Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells: Potential Role of Runx2 Deacetylation [J]. PLoS ONE, 2012,7:doi:10.1371/journal.pone.0035712.

[22] Shakibaei M, Buhrmann C, Mobasheri A. Resveratrol-mediated SIRT- 1 interaction with p300 modulate receptor activator of NF-κB ligand(RANKL) activation of NF-κB signaling and inhibit osteoclastogenesis in bone-derived cells[J]. J Biol Chem, 2011, 286: 11492- 11505.