胰腺癌干細胞的研究現狀和若干進展

程明榮　張智平

摘 要 胰腺癌在消化道腫瘤中預后最差，化療極易耐藥，導致胰腺癌治療失敗的原因可能與胰腺癌干細胞有關。本文通過文獻復習，對胰腺癌干細胞的發現、分離、鑒定、信號轉導通路和靶向胰腺癌干細胞給藥系統的研究進行綜述，尤其是胰腺癌干細胞靶向給藥系統取得的較大進展，為臨床胰腺癌的治療帶來新的希望。

關鍵詞 腫瘤干細胞 靶向給藥系統 耐藥 信號轉導通路 胰腺癌

中圖分類號：R735.9 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2014）06-0028-06

胰腺癌是目前預后最差的消化道腫瘤，其發病率與死亡率接近。雖然，胰腺癌的研究取得了重要進展，但其預后仍很差，學者們仍在尋找新的治療方法。腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）學說的提出為尋找根治胰腺癌提供了新的理論基礎，該學說認為，在實體瘤或體外細胞系中存在的極少數細胞具有自我更新和多分化潛能，可能在腫瘤的發生發展以及放、化療耐藥中起到重要作用[1]。目前，胰腺癌干細胞已被證實具有自我更新、高致瘤性、活躍分化潛能和強耐藥性的特點，具有極高的惡性特點。

1 CSC的理論基礎

腫瘤由具有異質性的組織組成，關于腫瘤的異質性有兩種解釋：一種觀點認為異質性起源于不同類型的細胞，即具有干細胞樣特性的細胞，這種細胞來源于天然多功能干細胞，還是正常細胞經過突變后轉變為干細胞，尚不清楚；另一種觀點認為，腫瘤的異質性來自克隆演化，突變的腫瘤細胞生存并繁殖，突變優勢細胞群類似干細胞，具有促進腫瘤生長的能力。兩種觀點并非相互獨立，而是具有內在聯系。因此，CSC具有兩層含義[2-3]：①腫瘤起源于組織干細胞或胚胎細胞，具有自我更新的調節；②腫瘤是具有干細胞特性的細胞亞群。

2 CSC的簡要發展史

早在150年前，病理學家Connnheim和Duramte就提出，組織中存在的極少數干細胞可能是腫瘤的起始細胞。1994年，Lapidot等[4]首次通過特異細胞表面標志分離出人急性粒細胞白血病干細胞，發現只有白血病干細胞才具有不斷自我更新，維持其惡性顯性的作用，首次證明了CSC的客觀存在，是人類第一次分離出CSC。2003年，Al-Hajj等[5]成功分離出人類乳腺癌干細胞，通過連續移植實驗，誘發出非肥胖型糖尿病/重癥聯合免疫缺陷性小鼠（NOD/SCID）的乳腺癌。2004年從中樞神經系統腫瘤中分離出具有干細胞特性的細胞[6-7]，并在動物實驗中得到驗證。2005年，Saad等[8]從前列腺癌組織中成功分離出表型為CD44+/α2β1hi/CD133+的前列腺癌干細胞（約0.1%），其在體外有很高的增殖潛能并形成二次克隆，具有自我更新、無限增殖和分化的能力，在非雄激素依賴下長期存活。2005年Kim等[9]從小鼠非小細胞肺癌模型的最初階段分離到支氣管肺泡干細胞。2007年Li等[10]首次從手術切除標本中分離到CD44+CD24+ESA+胰腺癌干細胞，并通過小鼠的體內成瘤實驗證明其成瘤性，組織病理學特點與手術標本類似，證實該干細胞具有高度的自我更新能力。

3 CSC的鑒定方法

目前鑒定胰腺癌干細胞的方法主要有細胞表面標記、側群細胞（side populations，SP）實驗、成球生長實驗和動物致瘤性實驗。

3.1 細胞表面標志

主要利用細胞表面帶有特異性膜蛋白（即表面標志）的特點，經特異性抗體結合后，用流式細胞儀在熒光活化系統檢測下分選出熒光細胞。胰腺癌表面主要分子標志為CD44+CD24+ESA+、CD133+、乙醛脫氫酶1（ALDH1）、c-Met等。Olempska等[11]應用實時定量PCR檢測發現，ATP 結合盒（ATP-binding cassette， ABC）G2在細胞株Panel、Panc89、Colo-357、Panc Tul和A818-6中均顯著高表達，而CD133僅高表達于Pane Tul和A818-6細胞株，因此認為ABCG2+/CD133+細胞可能是胰腺癌干細胞，并且通過致瘤實驗得到驗證[12]。Jimeno等[13]在動物實驗中發現胰腺癌部分細胞高表達ALDH1，并且該細胞具有明顯的耐藥性，表現為CSC的特性。Li等[14]研究表明c-Met介導了胰腺癌干細胞的生長與轉移，可作為一種表面標志進行腫瘤細胞的分選。

3.2 SP細胞實驗

CSC具有ABC轉運蛋白的功能，能夠外排核酸染料Hoechst33342，而大部分非CSC不具備該蛋白。SP細胞實驗利用該特性，通過熒光顯微鏡和流式細胞技術觀察具有CSC特性的不著色細胞。Zhou等[15]分離出人胰腺癌細胞株panc-1中的SP細胞，并發現用吉西他濱處理后，SP細胞的比例明顯升高，并且該SP細胞具有較高的克隆形成能力和更強的成瘤能力。

3.3 成球生長實驗

CSC在特定的培養基可以形成干細胞球，從而特異富集CSC。其針對流式細胞分選出來的CSC的驗證，將分選出的CSC進行體外培養，通過懸浮細胞球的生長驗證CSC的自我更新和分化能力。細胞生長曲線實驗是對分選出的CSC進行體外培養，觀察細胞生長指數，并繪制生長曲線，通過對比普通腫瘤細胞的生長速度驗證CSC的增殖能力。

3.4 動物致瘤性的體內實驗

是指用一定數量的待測腫瘤細胞懸液接種至NOD/SCID小鼠體內，觀察是否會有腫瘤生成以及腫瘤的發展進程，用以評估待測細胞是否具有形成并維持腫瘤生長及異質性的能力。動物體內致瘤性實驗是目前驗證CSC的金標準。

4 胰腺癌干細胞的通路研究

胰腺癌干細胞與正常細胞一樣具有多分化潛能、自我更新能力和信號轉導通路，這些通路在胰腺癌干細胞的自我更新和自我調控中起到重要作用。在胰腺癌干細胞中表現得異常激活的通路有音猬因子（sonic hedgehog， Shh）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Notch、骨形態發生蛋白（BMP）、胰十二指腸同源蛋白1（PDX1）和B細胞特異性莫洛尼白血病毒插入位點-1（B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site-1， BMI-1）等。

4.1 Shh通路

在人胰腺癌組織中的Shh通路異常激活，胰腺干細胞Shh通路的激活程度是胰腺癌組織的11倍[10]，并且發現利用轉基因技術將Shh基因導入到正常胰腺中，可使胰腺組織向胰腺癌前病變方向發展，出現胰腺常見的基因突變類型，如K-ras基因突變、Her2/neu過表達等[16]，利用Shh通路抑制劑環巴胺抑制后，體外胰腺細胞增值明顯抑制[17]。

4.2 BMI-1通路

原癌基因BMI-1是轉錄抑制因子基因polycomb家族成員，它通過調節端粒酶的活性控制細胞的增殖和凋亡。參與正常干細胞調控作用的BMI-1在CSC的維持和自我更新中同樣具有重要作用，如乳腺癌、結腸癌等腫瘤中的CSC均明顯上調。有學者證實胰腺癌細胞（CD44+CD24+ESA+）中的BMI-1 mRNA具有異常表達，并認為在胰腺癌干細胞中的自我更新的維持上具有重要作用[18]。

4.3 Notch信號通路

Notch是非常保守的信號系統，其受體多與相鄰細胞間的膜結合配體結合而被激活。Notch途徑的激活過程是γ-分泌酶作用于Notch受體的細胞內結構域，該結構域從膜上脫落，移位到細胞核調控基因表達，從而影響細胞增值、分化和轉移過程。Notch通路的異常與胰腺癌干細胞的自穩具有明顯的相關性[19]，其確切關系仍在進一步的研究中。

4.4 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路

mTOR信號通路是新近發現的胞內信號通路，該通路可匯聚和整合來自營養、生長因子、能量和環境壓力對細胞的刺激信號，進而通過下游效應器真核細胞始動因子4E結合蛋白1（4EBP1）和核糖體S6蛋白激酶（S6KS）調節細胞生長，并發現該通路與胰腺癌干細胞的自我增值具有明顯的相關性。Mueller等[20]發現，胰腺癌干細胞的mTOR信號通道異常活躍，雷帕霉素是mTOR的抑制物，阻斷該信號通道可以抑制部分胰腺癌干細胞（CD133+）的生長，為了更好地殺滅干細胞，研究人員將雷帕霉素、環杷明和吉西他濱三藥聯合（CRG），發現對CSC的殺傷力極強，可以明顯延長無瘤生存時間，提示mTOR信號通路積極參與了胰腺癌干細胞的自我更新與分化。

4.5 PDX1途徑

PDX1是胰腺發育早期起重要作用的啟動基因表達的蛋白，在胰腺自我更新時，PDX1可在胰腺導管細胞中短暫表達，在胰腺導管腺癌中高表達[21-22]，其表達程度又與腫瘤的大小、分化程度以及淋巴結轉移等密切相關。并且發現這些特性都與CD133+，CXCR4+的胰腺癌CSC的特性非常吻合[23-24]。

4.6 基質細胞衍生因子1/侵襲前端趨化因子受體-4（SDF-1/CXCR4）軸

SDF-1/CXCR4軸無論是胚胎時期胰腺的形成還是損傷胰腺的修復均具有重要作用，可以促進細胞的增殖和遷移并促進胰管形成。有研究表明在胰腺癌CSC發生轉移之前，使用特異性抑制劑（AMD-3100或AMD-070）阻斷CXCR4的表達，會明顯降低胰腺癌的轉移發生率[25- 26]。

5 胰腺癌干細胞與轉移

胰腺癌一旦出現轉移，預后極其不佳，癌細胞的轉移過程涉及多種活性因子及酶的參與，并不是所有的胰腺癌細胞都具備轉移的能力，只有其中的一小部分會出現轉移并最終形成轉移瘤。Wellner等[27]研究發現，鋅指E-盒結合同源異形盒1（ZEB1）是胰腺癌細胞上皮間質轉化的激活因子，ZEB1通過抑制細胞microRNA-200的表達，阻止細胞的正常分化，激活細胞出現上皮間質轉化，并使癌細胞具備干細胞的表型，從而使癌細胞發生侵襲、轉移。因此提出ZEB1-microRNA-200反饋弧可以作為治療胰腺癌的靶點。Hermann等[28]發現侵襲性胰腺癌標本中，CD133胰腺癌干細胞與CXCR4+呈共表達。CD133+CXCR4+細胞和CD133+CXCR4-細胞均可在小鼠體內形成腫瘤，但是僅CD133+CXCR4+細胞的腫瘤發生轉移，提示可能存在兩種不同表型的胰腺癌干細胞，即穩定型干細胞和游走型干細胞；同時發現在小鼠模型中阻斷CXCR4胰腺癌干細胞與化療耐藥信號通路可抑制腫瘤轉移，這對臨床治療胰腺癌轉移有重要的指導意義。但目前仍未明確CXCR4+細胞來源于何處，是干細胞最初就富有的一種亞克隆，還是在腫瘤發展過程中干細胞受到微環境影響誘導產生的新亞型，因為這涉及如何確定通過抑制CXCR4+胰腺癌干細胞來阻止腫瘤轉移的治療策略，究竟是直接消滅CXCR4+的干細胞亞群，還是誘導干細胞分化進而減少干細胞抑制轉移。Singh等[29]使用吉西他濱聯合AMD3100封閉胰腺癌細胞CXCR4后，發現胰腺癌細胞的生長與轉移都受到了抑制，很好的驗證了Hermann的研究成果。

6 胰腺癌干細胞與耐藥性

耐藥的腫瘤細胞與CSC具有許多相似的特征，如大多處于細胞周期的G0期，不進入增殖周期，而大部分化療藥物作用于細胞增殖期，不能殺滅處于G0期的癌細胞，這些細胞的細胞膜ATP泵耐藥分子，具有極強的自我修復DNA損傷和抗凋亡的能力。越來越多的研究顯示胰腺癌干細胞介導了其對放化療的抵抗，Hermann等[30]采用吉西他濱干預CD133+CSC，發現其對吉西他濱明顯耐藥，干預5 d后其比例明顯上升，達細胞總數的50%。他們在體內實驗發現吉西他濱具有抑制胰腺癌生長的作用，但CD133+CSC的比例明顯升高，進一步說明CD133+CSC的耐藥性。Wang等[31]的研究支持Hermann的研究結果。Lee等[18]通過CD44+CD24+ESA+CSC移植瘤模型也證實胰腺癌干細胞對放、化療抵抗。他們用放療聯合吉西他濱化療干預上述模型時發現，移植瘤的生長不僅不被抑制反受到刺激，深入研究表明CD44+CD24+ESA+CSC在吉西他濱的作用下不會凋亡，僅停止增殖，一旦停止用藥，該細胞亞群又開始增殖和分化。Kallifatidis等[32]的研究發現，西蘭花提取物萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）能增強化療藥物對胰腺癌CSC的殺傷作用，體外實驗發現，通過抑制ALDH1和Notch-1表達可誘導凋亡和抑制細胞的增殖；體內實驗發現，SFN可以抑制種植瘤在裸鼠體內生長，且無不良反應。Rausch等[33]研究發現，腫瘤靶向藥物索拉非尼（Sorafenib）可以抑制胰腺癌CSC的增殖、分化和轉移，在種植瘤模型研究中，發現索拉非尼可以抑制種植瘤的生長和血管形成，但卻可以激活胰腺癌CSC中的核因子-κB（NF-κB），NF-κB是一種常見的轉錄因子，可以被炎性因子、生長因子或趨化因子等激活，NF-κB一旦被激活，就會使胰腺癌CSC死灰復燃，而將SFN與索拉非尼聯用，可以阻止NF-κB的激活，抑制癌細胞克隆增殖，徹底消滅胰腺癌CSC。

7 胰腺干細胞的臨床意義

腫瘤現有的藥物治療，雖然具有一定的療效，對腫瘤細胞具有明顯的抑制和控制作用，無論對轉移灶和原發灶，均是暫時的控制，大多數患者均可以發生復發和轉移，其中最為關鍵的問題是沒有徹底清除CSC。因此，消滅非成瘤細胞，可以使腫瘤縮小，但不能治愈，如果藥物直接針對CSC，直接將CSC進行清除和誘導CSC進行轉化，將對腫瘤的治療是一個歷史性的改變。因此針對胰腺癌干細胞的信號轉導通路的研究，會導致新的治療腫瘤方法的誕生。Mueller等[20]報道應用CRG三聯療法治療胰腺癌干細胞具有明顯的療效，但仍有一定的臨床風險，如雷帕霉素和環杷明聯用傳統化療藥有潛在的風險，可能對其他器官的功能同樣具有抑制作用。當然Mueller等[20]的CRG三聯療法在動物實驗中顯示裸鼠尚能耐受該療法，但應用于臨床還需大量的臨床前實驗。雖然此療法未進入臨床，但其優勢尚存，CRG三聯療法中的藥物均已經在臨床使用，可以減少巨大的工作量，而且各自的毒副作用已知，僅需研究聯合應用后的毒副作用，相對工作量減輕。

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（收稿日期：2014-01-07）