不同類型糖源對大菱鲆脂肪代謝酶活性和脂肪酸組成的影響＊

苗惠君，聶琴，苗淑彥，陳塵悅，李靜，張文兵＊＊，麥康森

（1.中國海洋大學水產動物營養與飼料農業部重點實驗室，山東 青島266003；2.中國石油大學（華東）生物技術與生物工程中心，山東 青島266580）

糖類作為飼料中最廉價的能量來源，不僅為動物的代謝活動提供能量，也是合成體脂的重要原料[1]。Hemre等[2]的研究表明，肝臟是魚類合成脂肪的主要場所，肝臟中的糖類有控制脂肪合成的作用。然而，不同類型的糖源對魚類脂肪代謝的影響不同，例如葡萄糖和麥芽糖比結構復雜的多糖更有利于高首鱘（Acipensertransmontanus）魚體脂肪的合成[3]；不同類型的糖源能夠影響銀鯽（Carassiusauratusgibelio）和中國長吻鮠（LeiocassislongirostrisGünther）的糖異生和脂肪合成代謝[4]。放射性同位素標記葡萄糖顯示，參與從頭合成脂質的糖類相當有限[5]。飼料中糖類促進機體脂肪重新合成主要通過增加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的量，而不是通過為脂肪提供碳架[6]。飼料中不同類型的糖源對魚體脂肪酸的組成也會產生影響，Degani等[7]的研究表明，歐洲鰻鱺（Anguillaanguilla）體脂肪酸的組成受飼料中不同糖源的影響。

大菱鲆（Scophthalmusmaximus）屬于硬骨魚綱（Osleichthyes）、鰈形目（Pleuronectiformes）、鰈亞目（Pleuronectoidei）、鲆科（Bothidae）、菱鲆屬 （Scophthalms），為原產于歐洲的名貴海水養殖品種[8]。自1992年引入我國以來，成為我國海水養殖中的一個重要魚類。大菱鲆為肉食性魚類，雖然肉食性魚類對飼料中糖類的利用率較差[9]，但飼料中適量的糖類可以提高條紋鱸（Moronechrysop♀×M.saxatilis♂）、牙鲆 （Paralichthysolivaceus）等肉食性魚類的增重率[10－11]。Nijhof等[12]的研究表明大菱鲆在糖類的代謝中沒有任何系統性缺陷。馬愛軍等[13]認為大菱鲆幼魚對飼料中糖的需求量為4%，并認為雖然大菱鲆對糖類的需求量較少，但適量的糖類對幼魚的生長和飼料利用等方面起到了一定的作用。然而，不同類型的糖源對大菱鲆幼魚脂肪代謝的影響尚不清楚。本研究擬通過分析大菱鲆幼魚攝食不同類型的糖源后，體內與NADPH的生成和脂肪分解代謝相關酶的活性，以及肌肉脂肪酸組成的變化，為闡明不同類型糖源對大菱鲆脂肪代謝的影響機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料配方和制作

以白魚粉、酪蛋白和明膠為主要蛋白源，以魚油和大豆卵磷脂為主要脂肪源，分別添加5%的葡萄糖（單糖），蔗糖（雙糖），糊精（多糖）（見表1），配制成3種含不同類型糖源的半精制實驗飼料。飼料原料粉碎過80目篩后，按逐級放大法混合均勻，加魚油攪拌均勻后加水制成一定硬度的面團，用雙螺桿擠壓機壓出顆粒（1.5 mm×3.0mm）飼料，50℃烘箱烘干后放于－20℃冰箱內保存備用。

表1 實驗飼料配方及營養成分（干物質）Table 1 Formulation and proximate compositions of the experiment diets /%

1.2 實驗動物及飼養管理

實驗用大菱鲆為山東省青島膠南育苗場當年人工孵化的同一批魚苗，養殖實驗在中國海洋大學鰲山衛實驗基地進行。實驗開始前，魚苗在室內流水式養殖系統內暫養2周，以商品飼料飽食投喂，使之逐漸適應養殖環境和人工配合飼料。暫養結束后停食24h，挑選體格健壯、規格均一的大菱鲆幼魚（8.77±0.16）g進行分組。共3個處理，每個處理3個重復，每個聚乙烯水族箱（500L）為1個重復，放養密度為28尾/箱。實驗期間每日飽食投喂2次（07：00，18：00），每日投喂后吸殘餌以保持水質。養殖實驗持續9周，期間水溫（19±1）℃，pH＝7.7±0.1，鹽度25.2±1，溶氧含量≥7.0mg/L。

1.3 取樣及樣品分析

實驗結束前，停喂實驗魚24h，每桶隨機取3尾大菱鲆，在冰上取其背部肌肉，－20℃保存，用于肌肉脂肪酸組成的測定；另在每桶隨機取3尾冰上迅速解剖，取肝臟、腸道，液氮速凍，后轉到－80℃保存，用于測定相關酶的活性。

1.3.1 飼料常規成分測定 飼料樣品按照AOAC[14]方法進行生化組成分析。其中，水分含量測定于105℃烘至恒重；粗蛋白采用半微量凱氏定氮法（總氮×6.25）；粗脂肪采用索氏抽提法；灰分測定于馬福爐中550℃下灼燒至恒重；總能用氧彈儀（Parr 6100，USA）測定；實驗飼料中糖含量以飼料中可利用糖含量計量，采用蒽酮比色法測定[15]。

1.3.2 相關酶活性測定 腸道的脂肪酶（LPS），肝臟的脂蛋白脂酶（LPL）、肝脂酶（HL）活性的測定均采用試劑盒（南京建成生物工程研究所），按試劑盒說明書操作。肝臟的葡萄糖－6－磷酸脫氫酶（G6PD）活性的測定，參考蔣傳葵等[16]的方法。肝臟的蘋果酸酶（ME）活性的測定，參考Wise等[17]所用的方法。

脂肪酶活性單位的定義：在37℃條件下，每克組織蛋白在反應體系中與底物反應1min，每消耗1μmol底物為1個酶活力單位。

脂蛋白脂酶和肝脂酶活性單位的定義：每毫克組織蛋白每小時在反應體系中所產生1μmol的游離脂肪酸（FFA）為1個酶活力單位。

總脂酶活性＝脂蛋白脂酶活性＋肝脂酶活性。

葡萄糖－6－磷酸脫氫酶、蘋果酸酶活性單位的定義為：每毫克組織蛋白在反應體系中1min內催化1nmol的NADP轉化NADPH定義為1個酶活力單位。

1.3.3 腸道和肝臟組織勻漿液蛋白含量測定 采用微量考馬斯亮蘭法測定腸道和肝臟組織勻漿液中的蛋白質含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，測定過程按照試劑盒說明書操作。

1.3.4 脂肪酸測定 肌肉中脂肪酸組成的測定參照徐瑋[18]的方法。氣相色譜儀：美國惠普公司HP6890型；毛細管柱：007－CW；柱溫：150℃（1min）經15℃/min到200℃，再經2℃/min升至250℃；汽化室溫度：270℃；檢測器溫度：270℃。數據處理：采用面積歸一法定量。

1.4 計算及統計

采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行單因素方差（ANOVA）分析，若差異顯著，則進行Tukey多重比較，顯著性水平為P＜0.05，實驗數據用平均值±標準誤（X ±S.E）表示。

2 結果

2.1 不同類型的糖源對大菱鲆脂肪合成相關酶活性的影響

飼料中不同類型的糖源顯著（P＜0.05）影響了大菱鲆葡萄糖－6－磷酸脫氫酶的活性（見表2）。糖源為葡萄糖時，肝臟中葡萄糖－6－磷酸脫氫酶的活性最高（40.18±0.68）nmol·min－1·mg－1Prot.，顯著高于其他處理組；該酶的活性在蔗糖和糊精處理組之間沒有顯著差異。蘋果酸酶的活性在飼料糖源為葡萄糖時顯著（P＜0.05）高于其他處理組；該酶的活性在蔗糖和糊精處理組之間沒有顯著差異（見表2）。

表2 不同類型糖源對大菱鲆脂肪合成相關酶活性的影響Table 2 Effects of different dietary carbohydrate complexity on lipogenic enzymes of turbot

2.2 不同類型的糖源對大菱鲆脂肪分解相關酶活性的影響

大菱鲆腸道脂肪酶的活性受飼料中不同類型糖源的顯著（P＜0.01）影響（見表3）。糖源為糊精時，脂肪酶的活性最高（21.11±0.36）U/g Prot.，顯著高于其他處理組；該酶活性在葡萄糖和蔗糖處理組之間沒有顯著差異。飼料中不同類型的糖源顯著（P＜0.05）影響了大菱鲆肝臟中脂蛋白脂酶的活性（見表3）。糖源為葡萄糖時，脂蛋白脂酶的活性為（0.30±0.02）U/mg Prot.，顯著低于其他處理組；該酶活性在蔗糖和糊精處理組之間沒有顯著差異。飼料中添加不同類型的糖源對大菱鲆肝臟中肝脂酶的活性沒有顯著影響（P＞0.05），但該酶活性隨著糖源結構復雜程度的增加呈現上升的趨勢（見表3）。大菱鲆肝臟總脂酶的活性受飼料添加不同類型糖源的顯著（P＜0.05）影響（見表3）。糖源為糊精時，總脂酶的活性最高（0.96±0.04）U/mg Prot.，顯著高于糖源為葡萄糖的組。

表3 不同類型的糖源對大菱鲆脂肪分解相關酶活性的影響Table 3 Effects of different dietary carbohydrate complexity on lipolytic enzymes of turbot

2.3 不同類型的糖源對大菱鲆肌肉脂肪酸組成的影響

飼料中以葡萄糖為糖源的處理組，大菱鲆肌肉飽和脂肪酸中的C16∶0和C18∶0的含量均顯著（P＜0.05）高于以糊精為飼料糖源的處理組，但是飼料中的不同糖源對C14∶0和C20∶0含量無顯著（P＞0.05）影響（見表4）。肌肉單不飽和脂肪酸中的C16∶1和C18∶1的含量均受不同類型糖源的顯著（P＜0.05）影響，糊精組顯著高于葡萄糖組（見表4）。飼料中不同類型的糖源對C18∶2n－6、C18∶3n－3、ARA、EPA、DHA 的含量無顯著（P＞0.05）影響。

表4 不同類型的糖源對大菱鲆肌肉中脂肪酸組成的影響Table 4 Effects of different dietary carbohydrate complexity on fatty acid compositions in the muscle of turbot

3 討論

苗淑彥等的研究表明，飼料中分別添加5%的葡萄糖、蔗糖或糊精對大菱鲆幼魚的特定生長率的影響，這三者之間沒有顯著差異，其變化范圍為2.05～2.10（%/d）。蔗糖組（0.82）大菱鲆的飼料系數顯著高于葡萄糖組（0.76），而與糊精組（0.78）沒有顯著差異；葡萄糖組（0.76）飼料系數與糊精組（0.78）沒有顯著差異（未發表數據）。

3.1 不同類型的糖源對大菱鲆脂肪合成的影響

魚類脂肪酸的合成主要在肝臟中進行。NADPH是合成脂肪酸所必需的原料，主要由葡萄糖－6－磷酸脫氫酶通過磷酸戊糖途徑（葡萄糖氧化分解的一種方式）產生，或由蘋果酸酶催化蘋果酸氧化脫羧生成丙酮酸的過程中產生。因此，葡萄糖－6－磷酸脫氫酶和蘋果酸酶是參與脂肪合成的重要酶[19]。本研究中飼料糖源為葡萄糖時，大菱鲆肝臟中葡萄糖－6－磷酸脫氫酶和蘋果酸酶的活性顯著高于其他處理組，而蔗糖和糊精處理組之間沒有顯著差異。Cui等[20]對軍曹魚（Rachycentroncanadum）幼魚的研究表明，飼料中糖源為葡萄糖的處理組中葡萄糖－6－磷酸脫氫酶的活性比糖源為蔗糖、麥芽糖、糊精、玉米淀粉、小麥淀粉的處理組活性都要高。Hung等[3]對高首鱘（Acipensertransmontanus）的研究也表明，以葡萄糖為糖源的處理組中葡萄糖－6－磷酸脫氫酶和蘋果酸酶的活性均比其他糖源的處理組高。同樣的結果在虹鱒（Oncorhynchusmykiss）的研究中也得到證實[21]。這些研究結果表明，葡萄糖比結構復雜的糖源更能促進魚體內脂肪的合成代謝。與攝入蔗糖、糊精等復雜度較高的糖源相比，魚體在攝入葡萄糖后，血糖含量更快的達到最高點而且高血糖的持續時間最短[22－25]，這就要求魚體增強其相應的葡萄糖代謝轉運機制，如本研究中葡萄糖－6－磷酸脫氫酶和蘋果酸酶活性的增加產生了更多的NADPH，從而增強了脂肪的合成作用，以此來作為調節高血糖的途徑之一。

3.2 不同類型的糖源對大菱鲆脂肪分解的影響

脂蛋白脂酶是脂蛋白代謝的關鍵酶，主要生理功能是催化極低密度脂蛋白和乳糜微粒所攜帶的甘油三酯水解轉變成為甘油和脂肪酸，以供各種組織儲存和利用[26]。本研究表明飼料中糖源為葡萄糖時，大菱鲆肝臟中脂蛋白脂酶的活性顯著低于其他處理組，該酶的活性在蔗糖和糊精處理組之間沒有顯著差異。肝脂酶主要在肝臟中合成，作用于乳糜微粒、極低密度脂蛋白代謝殘粒及高密度脂蛋白中的甘油三酯和磷脂的代謝[27]。本研究表明飼料中添加不同類型的糖源對大菱鲆肝臟中肝脂酶的活性沒有顯著影響，但肝脂酶的活性隨著糖源結構復雜程度的增加呈現上升的趨勢。肝脂酶和脂蛋白脂酶是魚類肝胰臟中參與脂肪分解的2種關鍵酶，合稱為總脂酶[28]。本研究結果表明，當飼料糖源為糊精時，大菱鲆肝臟總脂酶的活性顯著高于葡萄糖組。

通過對脂肪分解相關酶活性的分析可知，葡萄糖組的相關酶活性較其他組低。由此可推測復雜度高的糖源（如糊精）比葡萄糖易于被大菱鲆和某些魚類利用[10，29－34]的原因表現在2個方面，一方面羅毅平等[35]認為的由于復雜度高的糖類需要先水解為單糖才能被消化道吸收，因此復雜度高的糖類的吸收速率比單糖慢，魚體有足夠的時間調高糖類的分解轉化速率，從而減輕了糖吸收速率過剩的負效應。另一方面，由于復雜度高的糖源通過刺激脂肪分解相關酶的活性，加強了脂肪的分解供能作用，提高了魚體對飼料的利用效率，同時也降低了魚體脂肪過度沉積可能會引起疾病的風險。

3.3 不同類型的糖源對大菱鲆肌肉脂肪酸組成的影響

在脂類的合成過程中，首先由來自糖代謝的產物乙酰CoA合成軟脂酸C16∶0，然后通過碳鏈的加長或縮短合成其他的脂肪酸，進而合成甘油三酯[1]。飼料中以葡萄糖為糖源時，大菱鲆肌肉飽和脂肪酸中的C16∶0和C18∶0的含量均顯著高于以糊精為糖源的組。本研究中，在飼料脂肪酸來源一致的情況下，這種差異說明大菱鲆利用葡萄糖合成脂類的能力強于利用結構復雜的糖源，這與本研究中脂肪合成相關酶活性的分析結果一致。單不飽和脂肪酸是指含有一個雙鍵的脂肪酸，在魚油中的含量較多[36]。肌肉單不飽和脂肪酸中的C16∶1和C18∶1的含量均受不同類型糖源的顯著影響，糊精組顯著高于葡萄糖組，說明糊精為糖源時，能促進大菱鲆體內飽和脂肪酸的去飽和作用，從而增加不飽和脂肪酸的積累。必需脂肪酸是指不能被機體合成或者合成能力不足，而又是生物體生命所必需，必須由食物供給的脂肪酸[37]。n－3高不飽和脂肪酸，特別是ARA、EPA和DHA是鲆鰈魚的必需脂肪酸[38]。本研究中，飼料不同類型的糖源對肌肉中ARA、EPA和DHA的含量均無顯著影響。由此可見，飼料糖對大菱鲆肌肉脂肪酸的影響集中在飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸上，而對多不飽和脂肪酸的影響有限。但是，這種影響是否會導致大菱鲆對必需脂肪酸需求的改變，還有待于進一步研究。

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