“祛風(fēng)通竅方”對血管性癡呆大鼠海馬線粒體COX活性及COXⅡmRNA表達(dá)的影響

白雪 唐紅梅 葉麗莎 楊云芳 張德綢 羅剛

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川瀘州 646000）

“祛風(fēng)通竅方”對血管性癡呆大鼠海馬線粒體COX活性及COXⅡmRNA表達(dá)的影響

白雪 唐紅梅 葉麗莎 楊云芳 張德綢 羅剛

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川瀘州 646000）

目的：觀察祛風(fēng)通竅方對血管性癡呆（Vascu1ar dementia，VD）大鼠海馬線粒體細(xì)胞色素氧化酶（COX）及細(xì)胞色素氧化酶Ⅱ亞型（COXⅡ）mRNA表達(dá)的影響，探討祛風(fēng)通竅方對VD可能的保護(hù)機(jī)制。方法：大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組和祛風(fēng)通竅方高、中、低劑量組。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠采用經(jīng)典的永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈法制備VD模型。假手術(shù)組、模型組用等體積蒸餾水灌胃，各給藥組予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)30d。ELISA法檢測海馬線粒體COX活性；RT-PCR法檢測COXⅡmRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，其余各組大鼠COX活性明顯降低，COXⅡmRNA表達(dá)明顯降低；與模型組比較，尼莫地平組和祛風(fēng)通竅方高、中劑量組COX活性明顯升高，COXⅡmRNA表達(dá)明顯增加。結(jié)論：祛風(fēng)通竅方對VD大鼠線粒體功能具有一定的保護(hù)作用，可能與其改善VD大鼠線粒體COX活性，增加COXⅡmRNA的表達(dá)有關(guān)。

血管性癡呆 祛風(fēng)通竅方 海馬線粒體 COX COXⅡ 實(shí)驗(yàn)研究

血管性癡呆（Vascu1ar dementia，VD）是在各種腦血管疾病基礎(chǔ)上，因腦組織慢性缺血、缺氧而導(dǎo)致的以記憶、認(rèn)知功能障礙為特征的癡呆綜合征。本研究采用經(jīng)典的永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈（2-VO）法造模[1-3]，在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察“祛風(fēng)通竅方”對VD大鼠海馬組織線粒體細(xì)胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase，COX）活性及細(xì)胞色素C氧化酶Ⅱ亞型（cytochrome C oxidase subunitⅡ，COXⅡ）mRNA表達(dá)的影響，探討“祛風(fēng)通竅方”對VD的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠48只，普通級(jí)，12～24月齡，體重（350±20）g，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：2010-200。

1.2 藥物與試劑“祛風(fēng)通竅方”由麻黃10g、葛根30g、水蛭5g、地龍10g、全蝎5g、靈芝10g、石菖蒲20g組成。購入的中藥由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備成濃縮液，每1mL濃縮液相當(dāng)于原生中藥3g的含量。尼莫地平片由山西亞寶藥業(yè)生產(chǎn)。ELISA法試劑盒、RT-PCR試劑盒、天根RNA提取試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。內(nèi)參GAPD H引物（RT-PCR試劑盒內(nèi)帶）：上游5'-ACCACAGTCCAT GCCATCAC-3’，下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，產(chǎn)物長度400bp；COXⅡ引物（上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成）：上游5'-ACGCCACATCACCAATC-3’，下游5’-GCGAAGTTCACCTAGTT-3’，產(chǎn)物長度371bp。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組和祛風(fēng)通竅方高、中、低劑量組，每組8只。VD模型采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈法制備，假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎。造模后1月開始給藥，給藥劑量按照人與動(dòng)物之間用藥劑量換算得到祛風(fēng)通竅方高、中、低劑量組生藥量分別為26.8、13.4、6.7g/（kg·d）；尼莫地平組給予尼莫地平6.25mg/（kg·d），模型組、假手術(shù)組予等體積蒸餾水，各組均連續(xù)灌胃30d。

2.2 指標(biāo)檢測

2.2.1 海馬組織線粒體COX活性測定末次給藥后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉，斷頭取腦組織，剝離海馬，制備海馬組織勻漿，4℃、3500r/min離心15min，取上清液，4℃、12000r/min離心15min獲得線粒體，超聲細(xì)胞破碎儀破碎線粒體，根據(jù)說明書ABC-ELISA法試劑盒說明書測定COX活性。

2.2.2 RT-PCR法檢測海馬組織線粒體COXⅡmRNA表達(dá)

運(yùn)用RNA提取試劑盒提取海馬組織線粒體的RNA，進(jìn)行線粒體RNA濃度測定、純度測定后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。20μL反應(yīng)體系：5xRT Buffer4μL，dNTP Mixture（each 10mmo1/L）2μL，Super-RI 0.5μL，RT-Enhaner 0.5μL，Random Primer 1μL，Tota1 RNA 11μL，Rever Tra Ace 1μL；反應(yīng)條件：30℃10min—42℃35min—99℃5min—4℃5min，反應(yīng)結(jié)束后得到cDNA。PCR反應(yīng)體系20μL：RT反應(yīng)后原液2μL，RNase Free H2O 6μL，序列特異的上游引物（10pmo1/μL）1μL，序列特異的下游引物（10pmo1/μL）1μL，12xTaqPCR MasterMix 10μL；PCR擴(kuò)增條件：94℃變性30s，50℃解鏈30s，72℃延伸1min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取6μL產(chǎn)物，加6μL溴酚藍(lán)混勻，2%瓊脂糖凝膠上樣，然后電泳，當(dāng)電泳遷至凝膠全長的2/3處時(shí)終止電泳，取出凝膠，將凝膠置于凝膠成像儀內(nèi)拍照，用Quantity one軟件分別計(jì)算出各組COXⅡ-mRNA和GAPDH強(qiáng)度的比值，檢測大鼠海馬組織線粒體中COXⅡ-mRNA的相對含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量統(tǒng)計(jì)用（±s）描述，兩兩比較用LSD-t法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠海馬組織線粒體COX活性的比較與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組和祛風(fēng)通竅方高、中、低劑量組大鼠海馬組織線粒體COX活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，尼莫地平組和祛風(fēng)通竅方高、中劑量組COX活性明顯升高（P＜0.05），祛風(fēng)通竅方低劑量組COX活性無顯著性差異；與尼莫地平組比較，祛風(fēng)通竅方高、中劑量組COX活性明顯增高，低劑量組COX活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與祛風(fēng)通竅方高劑量組比較，中、低劑量組COX活性明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠海馬組織線粒體COX活性比較（±s）

表1 各組大鼠海馬組織線粒體COX活性比較（±s）

注：*與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；★與尼莫地平組比較，P＜0.05；◆與祛風(fēng)通竅方高劑量組比較，P＜0.05。

組別例數(shù)劑量假手術(shù)組COX（U/mg prot）8—0.5965±0.005#◆8—尼莫地平組86.25mg/（kg·d）0.4220±0.0047*#◆祛風(fēng)通竅方高劑量組826.8g/（kg·d）0.5397±0.0081*#★祛風(fēng)通竅方中劑量組813.4g/（kg·d）0.4856±0.0081*#★◆祛風(fēng)通竅方低劑量組86.7g/（kg·d）0.2918±0.0074*★◆模型組0.2909±0.0082*

3.2 各組大鼠海馬組織線粒體內(nèi)COXⅡmRNA表達(dá)情況

與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組和祛風(fēng)通竅方高、中、低劑量組相對灰度值明顯偏低（P＜0.05）；與模型組比較，祛風(fēng)通竅方高、中劑量組和尼莫地平組相對灰度值均有明顯升高（P＜0.05）；與尼莫地平組比較，祛風(fēng)通竅方高、中劑量組相對灰度值升高，低劑量組相對灰度值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與祛風(fēng)通竅方高劑量組比較，中、低劑量組灰度值明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠海馬組織線粒體內(nèi)COXⅡmRNA比較（±s）

表2 各組大鼠海馬組織線粒體內(nèi)COXⅡmRNA比較（±s）

注：*與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；★與尼莫地平組比較，P＜0.05；◆與祛風(fēng)通竅方高劑量組比較，P＜0.05。

組別例數(shù)劑量假手術(shù)組相對灰度值8—0.5274±0.0365#8—尼莫地平組86.25mg/（kg·d）0.2341±0.0179*#◆祛風(fēng)通竅方高劑量組826.8g/（kg·d）0.4091±0.0559*#★祛風(fēng)通竅方中劑量組813.4g/（kg·d）0.3196±0.0393*#★◆祛風(fēng)通竅方低劑量組86.7g/（kg·d）0.1651±0.1013*★◆模型組0.1627±0.0971*

4 討論

目前認(rèn)為VD的發(fā)生、發(fā)展與腦卒中有密切關(guān)系，與腦卒中的其他危險(xiǎn)因素也相關(guān)，VD的發(fā)病機(jī)制認(rèn)為有氧化應(yīng)激損傷、興奮性氨基酸毒性、膽堿能受損、炎癥反應(yīng)、程序性細(xì)胞凋亡等。VD雖是多種因素參與的復(fù)雜的慢性的病理過程，其線粒體（mitochondrion，MIT）氧化損傷起著關(guān)鍵性的作用。COX存在于MIT內(nèi)膜上，其參與MIT有氧呼吸及能量產(chǎn)生。在腦組織慢性缺血缺氧時(shí)，MIT功能障礙，生成過多氧自由基（Oxygen free radica1s，OFR），能量生成障礙，MIT受損，神經(jīng)元退化、變性、壞死等，使得VD的病情進(jìn)一步加重。

COX存在于線粒體內(nèi)膜上，是一種由nDNA和mtDNA復(fù)合的跨膜蛋白，是呼吸鏈中電子傳遞鏈的關(guān)鍵酶，轉(zhuǎn)移電子到氧氣分子（O2）并把O2還原為水。COX與有氧代謝及呼吸密切相關(guān)，其活性不僅受線粒體周圍化學(xué)環(huán)境的影響，更受遺傳物質(zhì)COXⅡ的影響。COX在參與有氧代謝時(shí)將線粒體氧化磷酸化（Oxidative phosphory1ation，OXPHOS）過程中的能量轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘眨╝denosine triphosphate，ATP），為神經(jīng)細(xì)胞提供能量。當(dāng)大腦長期慢性缺血缺氧后，腦組織內(nèi)OFR生成增多，線粒體成為OFR攻擊的靶點(diǎn)，線粒體功能受損，由mtDNA編碼的COXⅡ表達(dá)受到抑制[7]，進(jìn)而使得COX活性下降，線粒體的OXPHOS過程發(fā)生障礙，ATP產(chǎn)生也發(fā)生障礙，神經(jīng)元細(xì)胞受損，發(fā)生遲發(fā)性的變性、壞死等，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)、記憶功能。當(dāng)COX活性下降后，O2不能被還原，生成過多的OFR，使得線粒體編碼基因發(fā)生紊亂，線粒體編碼的亞型基因COXⅡ表達(dá)受到抑制，形成惡性循環(huán)，最終線粒體形態(tài)及功能受損。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧時(shí)，OFR的增加對膜脂、蛋白質(zhì)、DNA及其他大分子物質(zhì)造成損傷，抑制COXⅡ的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使COXⅡ表達(dá)下降[8]。

VD的防治多為危險(xiǎn)因素的干預(yù)，治療原發(fā)性腦血管病；當(dāng)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙時(shí)，常給予藥物改善。常用的有膽堿酯酶抑制劑、改善腦循環(huán)的藥物、促進(jìn)腦細(xì)胞代謝的藥物、神經(jīng)生長因子、自由基清除劑、高壓氧治療等。其中改善微循環(huán)藥中非二氫吡啶類Ca2+拮抗劑尼莫地平是迄今選擇性擴(kuò)張腦血管最強(qiáng)的Ca2+通道阻滯劑，易透過血腦屏障，臨床廣泛用于VD的治療[4-6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組COX的活性及COXⅡ的mRNA表達(dá)下降，尼莫地平組和祛風(fēng)通竅方高、中劑量組COX活性、COXⅡmRNA表達(dá)較模型組明顯升高；與尼莫地平組比較，祛風(fēng)通竅方高、中劑量組COX活性、COXⅡmRNA表達(dá)明顯升高。

本研究基于文獻(xiàn)提出五臟六腑皆有玄府，腦亦不例外，認(rèn)為腦之玄府不通乃為VD發(fā)病根本[9-10]。治療原則為“開通玄府，滋補(bǔ)促智”。因“高巔之上，唯風(fēng)藥易到”，故組方中重用風(fēng)藥，配伍滋補(bǔ)藥、蟲類藥。祛風(fēng)通竅方中麻黃、葛根為君，通玄府，散精氣；水蛭、地龍、全蝎“血肉有情”之品為臣，可搜風(fēng)通絡(luò)，通玄府；佐靈芝益氣扶正，滋補(bǔ)五臟；石菖蒲為使，開竅寧神，取其清輕流動(dòng)之性，引藥直達(dá)腦竅。諸藥合用，共奏祛風(fēng)通竅、活血化瘀、滋補(bǔ)促智的功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，麻黃對自氧化有較強(qiáng)的抑制作用，能清除氧自由基，起到抗氧化作用；葛根具有清除氧自由基抗脂質(zhì)過氧化、抗血小板聚集、抗腫瘤等多種作用；水蛭可降低腦細(xì)胞的凋亡，減少神經(jīng)元的不可逆損傷；地龍具有抗血栓、增強(qiáng)免疫、抗氧化等作用；全蝎抗血栓、抗氧化；靈芝抗氧化，提高記憶力；石菖蒲清除氧自由基，抑制神經(jīng)元凋亡。本實(shí)驗(yàn)說明祛風(fēng)通竅方在一定程度上減弱了OFR對線粒體編碼的COXⅡ基因表達(dá)的影響，使COX活性改善，發(fā)揮抗氧化的作用，從而對線粒體起著保護(hù)功能，此作用存在一定的量效關(guān)系。

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R749.130.5

A

1672-397X（2014）05-0075-03

白雪（1972-），女，醫(yī)學(xué)碩士，主任中醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腦病的基礎(chǔ)與臨床研究。bx7246@163. com

2014-01-20

編輯：吳寧

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（11ZA152）；瀘州市科技局項(xiàng)目（2012-S-38）