齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物酸水解工藝及水解后苷元含量測定*

李古月，劉佳鑫，才 謙

（1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽 110000；2.中國醫(yī)科大學藥學院，沈陽 110000；3.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，大連 116600）

齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物酸水解工藝及水解后苷元含量測定*

李古月1，2，劉佳鑫1，2，才 謙3

（1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽 110000；2.中國醫(yī)科大學藥學院，沈陽 110000；3.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，大連 116600）

[目的]確立齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物的最佳水解工藝，并對水解后的苷元進行含量測定。[方法]通過正交實驗設計確定齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物的最佳酸水解條件，利用此酸水解條件，對齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物進行酸水解，并采用高效液相色譜法對水解產(chǎn)物中的3種苷元進行含量測定。[結(jié)果]確定齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物的最佳酸水解條件為：鹽酸-甲醇濃度為4.0 mol/L，水解溫度為78℃，水解時間為4 h，經(jīng)過HPLC法測定，水解產(chǎn)物算得到酸法水解后總黃酮苷元的平均含量為58.38%±1.34%，其中木犀草素為12.06%±1.43%，槲皮素為9.66%± 0.32%，芹菜素為36.66%±2.34%。[結(jié)論]該水解方法可有效水解齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物，HPLC測定方法準確、可靠，可作為控制齒葉白鵑梅葉總黃酮水解產(chǎn)物質(zhì)量的定量依據(jù)。

齒葉白鵑梅；總黃酮；酸水解；含量測定

齒葉白鵑梅（Exochorda serratifolia S.Moore.），是薔薇科繡線菊亞科白鵑梅屬植物[1]，主要生長在遼寧凌源、喀左及河北一帶，其花蕾和幼葉可食用。民間多用其預防和治療糖尿病。本課題組對其化學成分進行了分離，從中得到蘆丁、木犀草素-7-O-β-D-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-新橙皮糖苷等十幾種黃酮類化合物[2-3]。同時本課題組對齒葉白鵑梅葉進行了藥理活性研究，證明其確有改善小鼠耐糖量和降血糖的作用[4]。

前期采用大孔樹脂法對齒葉白鵑梅中的總黃酮進行富集和純化，得到總黃酮提取物，采用分光光度法測得提取物中總黃酮的含量達到60%左右。由于總黃酮提取物中含有較多的分別以芹菜素、木犀草素和槲皮素為苷元形成的多種苷，本實驗對這些黃酮苷的水解條件進行研究，通過水解使黃酮苷轉(zhuǎn)化成木犀草素、槲皮素、芹菜素3種黃酮苷元，并用高效液相色譜法測定這3種苷元含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（包括真空脫氣機、四元泵、柱溫箱、VWD、HP1100化學工作站）（美國安捷倫科技有限公司），CP225D型電子天平（Sartorius，十萬分之一）。

1.2 試藥 木犀草素、槲皮素、芹菜素對照品（批號分別為20120206,20120213,20120314，上海源葉生物科技有限公司），齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物（總黃酮含量為60.51%），水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物水解工藝考察

2.1.1 供試品溶液的制備和色譜條件 供試品溶液的制備，稱取100 mg齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物，加入一定濃度的鹽酸-甲醇溶液，于一定溫度的水浴中反應一定時間，冷卻后過濾，用甲醇定容至50 mL，過0.45 μm濾膜后用HPLC檢測，通過正交試驗確定最佳酸水解條件。

色譜條件如下，色譜柱Promosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-2%冰乙酸梯度洗脫（梯度洗脫程序見表1），柱溫25℃，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長267 nm。

2.1.2 水解工藝考察 水解時間的確定，固定水解溫度為78℃，鹽酸濃度為5.0 mol/L，分別水解1、2、3、4、6 h，用HPLC檢測，計算水解率，結(jié)果見圖1。由圖1可知，水解時間為2～4 h水解效果較好[5-7]。

水解率=（水解后總苷元-水解前總苷元）/水解后總苷元

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program for mobile phase

圖1 水解時間的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time

鹽酸濃度的確定方法如下，固定水解溫度78℃，鹽酸濃度分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mol/L，水解2 h，用HPLC檢測，計算水解率，結(jié)果見圖2。由圖2可知，鹽酸濃度為3.0～5.0 mol/L水解效果較好。

圖2 鹽酸濃度的影響Fig.2 Effect of the concentration of hydrochloric acid

水解溫度的確定如下，固定鹽酸濃度為5.0 mol/L，溫度分別為48、58、68、78、88℃，水解2 h，用HPLC檢測，計算水解率，結(jié)果見圖3。由圖3可知，水解溫度為58～78℃水解效果較好。

2.1.3 正交實驗 考察多因素的綜合效果，以L9（33）正交實驗表安排實驗（見表2），實驗結(jié)果及方差分析分別見表3、表4。

圖3 水解溫度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature

表2 正交實驗因素水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物水解正交實驗及結(jié)果Tab.3 The result of hydrolysis flavonoid aglycones from Exochorda serratifolia S.Moore.leaves orthogonal experiment

表4 正交實驗方差分析表（F0.05=34.402）Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment（F0.05=34.402）

由表3可以看出，R2＞R3＞R1，即在影響水解率的因素中，鹽酸-甲醇濃度的影響程度最大，水解時間其次，水解溫度最次。從表4也可以看出，PB＜0.05，PA，PC＞0.05，說明鹽酸-甲醇濃度是影響水解程度的主要因素，且具有統(tǒng)計學意義。將K值進行比較，KA3＞KA2＞KA1，KB2＞KB3＞KB1，KC3＞KC1＞KC2，由此可得三因素的最佳水平組合為A3B2C3，即酸法水解最佳工藝條件為：鹽酸-甲醇溶液的濃度為4.0 mol/L，水解時間為4 h，水解溫度為78℃。

2.2 水解產(chǎn)物中3種黃酮苷元的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱PromosilC18色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-2%冰乙酸（27∶73）；柱溫25℃，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長267 nm[6，8-9]。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取木犀草素、槲皮素、芹菜素11.85、10.92、11.70mg，甲醇定容至25mL，搖勻，即得3種對照品溶液，濃度分別為0.474 0、0.436 8、0.468 0 g/L，備用。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物100 mg，加入4.0 mol/L鹽酸-甲醇溶液50 mL，于78℃的水浴中反應4 h，冷卻后過濾，用甲醇定容至50 mL，過0.45 μm濾膜，即得。

2.2.4 線性范圍的考察 取上述3種對照品溶液，分別進樣2、4、6、8、10、20 μL，經(jīng)HPLC檢測后，分別以進樣量為橫坐標，吸收峰面積為縱坐標，得回歸方程，見表5。

表5 標準曲線表Tab.5 Table of standard curve

2.2.5 精密度實驗 取各對照品溶液，分別連續(xù)進樣6次，以峰面積計算RSD值。結(jié)果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的RSD值均小于2.0%。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、16、24 h進樣，測定峰面積，計算RSD值均小于2.0%。

2.2.7 重復性實驗 取同一批樣品5份，分別測定木犀草素、槲皮素、芹菜素含量，計算RSD值均小于2.0%。

2.2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品6份，分別精密加入3種對照品溶液，測定含量，并計算回收率。結(jié)果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的平均加樣回收率分別為95.2%±0.76%，94.7%±0.54%， 97.5%±0.54%，RSD值均小于2.0%。

2.2.9 樣品含量測定 取3批供試品溶液，利用上述確定的水解條件進行酸水解。采用HPLC法檢測水解產(chǎn)物中槲皮素、木犀草素和芹菜素的含量，計算得到酸法水解后總黃酮苷元的平均含量為58.38%±1.34%，其中木犀草素為12.06%±1.43%，槲皮素為9.66%±0.32%，芹菜素為36.66%±2.34%。

圖4 水解前后樣品色譜圖及各對照品色譜圖Fig.4 Chromatogram of the sample before and after hydrolysis and reference substance solution

3 討論

本實驗通過正交實驗設計，確立了齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物的最佳酸水解條件。利用該水解工藝對總黃酮提取物進行酸水解，使提取物中多種由木犀草素、槲皮素和芹菜素與糖組成的黃酮苷轉(zhuǎn)化為相應的苷元。同時，建立3種苷元的HPLC測定方法，對3種苷元進行含量測定。

實驗結(jié)果表明，該水解工藝可以有效的水解齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物，HPLC法分析樣品中木犀草素、槲皮素和芹菜素3種苷元，方法簡便、重復性好，回收率高，可作為控制齒葉白鵑梅葉總黃酮水解產(chǎn)物質(zhì)量的定量依據(jù)。

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Study on acid hydrolytic conditions of total flavonoids and the determination of flavonoid aglycones from Exochorda serratifolia S.Moore.leaves

LI Gu-yue1,2，LIU Jia-xin1,2，CAI Qian3
（1.The First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110000,China;2.Pharmacy College of China Medical University, Shenyang 110000,China;3.Pharmacy College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China）

[Objective]To establish the acid hydrolytic conditions of total flavonoids and to determine the flavonoid aglycones from Exochorda serratifolia S.Moore.leaves.[Methods]The acid hydrolytic conditions were optimized by the means of orthogonal test and the contents of the flavonoid aglycones were determined by HPLC.[Results]The optimum conditions of acid hydrolysis were:concentration of hydrochloric acid 4.0 mol/L,temperature 78℃,time 4 h.The contents of luteolin,quercetin and apigenin were 12.06%±0.32%,9.66% ±1.43%and 36.66%±2.34%respectively.[Conclusion]This method is accurate and reliable and can be used in the determination of the flavonoid aglycones in Exochorda serratifolia S.Moore.leaves.

Exochorda serratifolia S.Moore;flavonoids;acid hydrolysis;content determination

R284.2

：A

：1672-1519（2014）05-0306-04

2013-12-25）

（本文編輯：高 杉，張震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.05.18

國家自然科學基金項目（81202919）。

李古月（1984－），女，藥師，從事臨床制劑指導工作。