扶腎降濁方對腎小管間質損害大鼠抗纖維化因子HGF、BMP-7的影響*

李春雨，魏曉露，蘇瑋蓮，李國霞

（天津醫科大學國際醫學院，天津 300070）

扶腎降濁方對腎小管間質損害大鼠抗纖維化因子HGF、BMP-7的影響*

李春雨，魏曉露，蘇瑋蓮，李國霞

（天津醫科大學國際醫學院，天津 300070）

[目的]探討扶腎降濁方對系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）大鼠腎小管間質損害的療效機制。[方法]在MsPGN動物模型基礎上，延長造模時間至20周，使其自然發展為腎小管間質損害模型。實驗設中藥組、西藥組、模型組及空白組。中藥組給予扶腎降濁方，西藥組給予貝那普利，模型組和空白組給予生理鹽水，連續20周，分別于實驗第12、16和20周末取材，采用實時逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和免疫組織化學法檢測大鼠腎組織抗纖維化因子肝細胞生長因子（HGF）、骨形態發生蛋白-7（BMP-7）mRNA及蛋白表達水平。[結果]模型大鼠腎組織HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表達下調，扶腎降濁方隨著給藥周期的延長可部分逆轉間質損害造成的上述mRNA和蛋白表達異常。[結論]扶腎降濁方對MsPGN大鼠腎小管間質損害保護作用機制可能與調節抗纖維化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表達有關。

扶腎降濁方；腎小管間質損害；肝細胞生長因子；骨形態發生蛋白-7

慢性腎功能衰竭是危害人民健康和生命的常見病，在自然人群中的年發病率為（98~198）/100萬，發達國家發病率更高[1]。現代研究表明，腎小管間質損害是導致慢性腎功能衰竭的重要原因[2]。腎小管間質損害是腎小球腎炎由炎癥啟動進展至腎小球硬化的中間環節，腎小球腎炎進展至腎小球硬化，大多已不可逆轉，而對其中間環節即腎小管間質損害進行早期有效干預則可極大延緩腎小球腎炎進展，對防治慢性腎臟疾病具有重要意義[3-6]。扶腎降濁方在臨床廣泛用于慢性腎臟疾病的治療，多年的臨床實踐取得了總有效率為82.5%的療效[7]。動物實驗表明，扶腎降濁方能改善慢性腎功能衰竭大鼠的常規生化指標，延緩腎功能衰竭的病理進程[8]。但對腎小管間質損害的保護作用機制尚不十分清楚。本研究基于抗纖維化因子肝細胞生長因子（HGF）、骨形態發生蛋白-7（BMP-7）對腎小管間質損害的調控作用，探討扶腎降濁方對系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）腎小管間質損害的保護作用機制。

1 材料

1.1藥物與試劑 扶腎降濁方組成：山茱萸12 g，生黃芪30g，白花蛇舌草30g，丹參30g，鬼箭羽30g，益母草30g，實驗所用中藥制劑為天津中醫藥大學中藥學院按既定工藝制備的配方顆粒，每克含生藥4.06g，批號20120810；鹽酸貝那普利片，北京諾華制藥有限公司，批號X1801；葡萄球菌腸毒素B（SEB），軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑，美國Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA），美國Amresco公司；TRNzol Reagent、反轉錄試劑盒、實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；兔抗大鼠BMP-7抗體，英國Abcam公司；兔抗大鼠HGF抗體，英國Abcam公司；過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒，北京尚柏生物醫學技術有限公司。

1.2 動物 雄性Wistar大鼠72只，體質量（150±10）g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所提供，合格證號：SCXK（軍）2009-003。

1.3 儀器 ABI 7500型實時熒光定量基因擴增儀，美國應用生物系統公司產品；LEICA組織處理系統（ASP200脫水機、EG1150包埋機、RM2245切片機），德國徠卡公司產品；奧林巴斯BX51顯微鏡成像系統，日本奧林巴斯公司產品。

2 方法

2.1模型制備與分組 將雄性Wistar大鼠72只，按隨機數字表法隨機分為4組：中藥組、西藥組、模型組和正常組，每組18只。造模方法參考相關文獻[9-10]，并加以改進：于實驗第1天隔日灌胃，給予10 g/L BSA水溶液，共20周，空白組給予等體積生理鹽水。第1天除正常組外各組每只大鼠分點注射完全弗氏佐劑0．2 mL，第8天注射不完全弗氏佐劑0．2 mL，第8、15天尾靜脈注射SEB 0．4 mg/kg，空白組注射等體積生理鹽水。自造模第1天，中藥組以扶腎降濁方生藥51．5g/kg灌服，西藥組以貝那普利4mg/kg灌服，正常組和模型組灌服等體積生理鹽水，共20周。第12、16、20周末每組隨機選取6只大鼠剖取腎組織用于各項指標的檢測。

2.2檢測指標

2.2.1實時RT-PCR Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說明書進行cDNA第一鏈的合成。以反轉錄產物為模板，引物序列見表1，進行實時RT-PCR反應。反應體系為20 μL：2×Super Real PreMix Plus 10 μL，正反向引物（10μmol/L）各0．6μL，模板（反轉錄產物）1 μL，50×ROX Reference Dye 0．4 μL，ddH2O 7．4 μL。反應條件：95℃預變性15 min；95℃變性10 s；50～60℃退火/延伸30 s；循環40次。反應結束后自動生成溶解曲線，結果以Ct值表示，采用2-△△Ct法對目的基因進行相對定量分析[11]。

表1 基因引物序列及片段Tab.1 Primer sequences and fragments

2.2.2免疫組織化學法 取部分腎組織脫水、石蠟包埋、3 μm厚切片，常規脫蠟、水化。加一抗兔抗大鼠HGF（1∶80）、BMP-7（1∶75），4℃過夜，加生物素化山羊抗兔IgG，37℃45 min，DAB顯色，蘇木素復染、封片鏡檢，在低倍鏡下（×200），每張切片隨機選取5個腎小管間質區域視野，采用IPP 6．3專業圖像分析軟件進行分析，計算各區域單位面積HGF、BMP-7蛋白陽性細胞數，取其平均值為該標本HGF、BMP-7蛋白的相對含量[12]。

2.3統計分析 SPSS18．0軟件進行統計學分析。計量資料均以均數±標準差（±s）表示。正態分布計量資料組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法；偏態分布計量資料比較采用秩和檢驗，P＜0．05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1扶腎降濁方對腎組織HGF、BMP-7mRNA表達的影響 MsPGN大鼠腎小管間質損害后，模型組與空白組比較，HGF、BMP-7 mRNA表達下調（P＜0．05）。隨著造模周期的延長，扶腎降濁方和貝那普利在第12、16和20周均可明顯上調腎組織HGF、BMP-7 mRNA表達（P＜0．05），無明顯時間依懶性。結果見表2和表3。

表2 扶腎降濁方對腎組織HGF mRNA表達的影響（±s）Tab.2 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on mRNA expression of HGF in renal tissue（±s）

表2 扶腎降濁方對腎組織HGF mRNA表達的影響（±s）Tab.2 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on mRNA expression of HGF in renal tissue（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 劑量 n 給藥12周 給藥16周 給藥20周空白組 - 6 0．64±0．27 0．44±0．29 0．26±0．17模型組 - 6 0．15±0．06* 0．02±0．01* 0．01±0．00*中藥組 17．01 g/kgm 6 0．58±0．18*#0．33±0．11*#0．20±0．07#西藥組 01．80 mg/kg 6 0．63±0．19#0．38±0．12*#0．24±0．18*#

表3 扶腎降濁方對腎組織BMP-7 mRNA表達的影響（±s）Tab.3 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on mRNA expression of BMP-7 in renal tissue（±s）

表3 扶腎降濁方對腎組織BMP-7 mRNA表達的影響（±s）Tab.3 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on mRNA expression of BMP-7 in renal tissue（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 劑量 n 給藥12周 給藥16周 給藥20周空白組 - 6 0．32±0．41 0．44±0．13 0．28±0．13模型組 - 6 0．03±0．01* 0．04±0．03* 0．02±0．01*中藥組 17．01 g/kg 6 0．30±0．18*#0．32±0．15*#0．27±0．15#西藥組 1．8 mg/kg 6 0．28±0．19*#0．31±0．21*#0．25±0．10*#

3.2扶腎降濁方對腎組織HGF、BMP-7蛋白表達的影響 MsPGN大鼠腎小管間質損害后，模型組與空白組比較，HGF、BMP-7蛋白表達下調（P＜0．05）。隨著造模周期的延長，扶腎降濁方和貝那普利在第12、16和20周均可明顯上調腎組織HGF、BMP-7蛋白表達（P＜0．05），無明顯時間依懶性。結果見表4和表5。

4 討論

腎小球疾病引起腎小管間質損害，并最終導致腎小管間質纖維化的病理生理過程，主要經歷4個階段：第一階段是細胞的活化和受損階段；第二階段是促纖維化因子的釋放，同時一些抗纖維化的因子也被釋放，如HGF、BMP-7等，可引起抗纖維化反應，參與腎臟的自身防御，促進炎癥消散和組織修復，“攻擊”和“防御”的平衡決定腎臟疾病的轉歸；第三階段纖維化的形成；第四階段是腎臟結構和功能受損。因此，第一和第二階段是腎小管間質纖維化過程中的關鍵環節[13-15]。筆者前期研究發現，MsPGN大鼠發展為腎小管間質損害后，腎組織TGF-β1/ Smads/ILK信號轉導通路發生改變，其中TGF-β1、Smad3、ILK基因表達上調，Smad7基因表達下調，扶腎降濁方可干預TGF-β1/Smads/ILK信號轉導通路逆轉腎小管損害造成的上述基因表達異常，進而負性調節腎小管上皮細胞間質轉分化，減少炎細胞的浸潤與減輕腎小管間質和腎小球損傷，延緩腎小管間質損害病程的進展[16]。本研究從腎小管間質纖維化過程的第二階段著手，觀察扶腎降濁方對腎小管間質損害大鼠抗纖維化因子HGF、BMP-7的影響，探討扶腎降濁方對系膜增生性腎炎腎小管間質損害的保護作用及可能機制。

表4 扶腎降濁方對腎組織HGF蛋白表達的影響（±s）Tab.4 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on protein expression of HGF in renal tissue（±s）

表4 扶腎降濁方對腎組織HGF蛋白表達的影響（±s）Tab.4 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on protein expression of HGF in renal tissue（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 劑量 n 給藥12周 給藥16周 給藥20周空白組 - 6 29．17±4．26 29．83±4．07 28．83±2．79模型組 - 6 17．17±3．60* 18．83±4．40* 17．17±2．79*中藥組 17．01 g/kg 6 38．33±3．56*#39．17±3．49*#38．33±2．88*#西藥組 1．8 mg/kg 6 29．50±2．43#29．17±2．04#29．33±3．01#

表5 扶腎降濁方對腎組織BMP-7蛋白表達的影響（±s）Tab.5 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on protein expression of BMP-7 in renal tissue（±s）

表5 扶腎降濁方對腎組織BMP-7蛋白表達的影響（±s）Tab.5 Effect of Fushen Jiangzhuo formula on protein expression of BMP-7 in renal tissue（±s）

注：與空白組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別 劑量 n 給藥12周 給藥16周 給藥20周空白組 - 6 60．50±4．85 61．83±2．93 63．00±4．69模型組 - 6 12．33±3．27* 12．33±3．08* 11．83±4．54*#中藥組 17．01 g/kg 6 29．67±5．16*#34．00±5．06*#36．33±2．42*#西藥組 1．8 mg/kg6 39．50±3．39*#48．83±2．40*#48．50±3．08*#

HGF和BMP-7是重要的腎營養因子，負性調節腎纖維化[17]。HGF是一種對多種器官具有多效性的多肽細胞因子，在動物模型中能明顯抑制患病腎臟系膜細胞及成纖維細胞的活化。可拮抗TGF-β1介導成纖維細胞激活，阻斷小管細胞轉化而發揮其保護腎臟阻止其纖維化作用，而HGF水平下降會加重腎纖維化程度。BMP-7是另一種重要的腎營養因子，廣泛表達于各種腎臟細胞且對腎臟的發育起著決定性作用[18]。在腎臟發育過程中，BMP-7缺乏導致后腎間充質細胞死亡。BMP-7缺乏的小鼠在圍產期死于尿毒癥[19]。

根據中醫理論，慢性腎小球腎炎發展到腎小管間質損害階段，既有臟腑功能的虛損，又有濕熱瘀濁等病理產物的蓄積。脾腎兩虛（尤其是腎虛）是其發病的內在因素，濕熱瘀濁是其遷延不愈的病理基礎，為此，筆者建立了扶腎降濁法為治療本病的基本大法，以此為指導配伍組成扶腎降濁方[20]。扶腎降濁方由山茱萸、斂精固澀，生黃芪、白花蛇舌草、丹參、鬼箭羽、益母草6味中藥組成，山茱萸益肝腎之陰，斂精固澀生黃芪補肺脾之氣，兩藥相伍，使滋陰不至于呆膩，補氣不過于溫燥，以扶腎固本；白花蛇舌草清熱利濕解毒，丹參、鬼箭羽、益母草活血化瘀，利水消腫，清除體內濕熱、瘀濁等病理產物，恢復機體的正常代謝功能，以治標。諸藥合用，標本兼治，既有整體調節，又有對因治療，從而達到控制疾病進展的目的。本研究發現，MsPGN大鼠發展為腎小管間質損害后抗纖維化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白表達水平均明顯下降，隨著造模周期的延長，扶腎降濁方能部分逆轉腎小管損害造成的上述mRNA和蛋白表達的異常，提示扶腎降濁方可通過改善抗纖維化因子HGF、BMP-7 mRNA和蛋白的低表達，可能是其發揮保護腎小管間質作用的機制，本研究為中醫藥防治慢性腎功能衰竭提供了新的思路。

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Effect of Fushen Jiangzhuo formula on anti-fibrosis factors of HGF and BMP-7 in rats with renal tubulointerstitial lesion

LI Chun-yu,WEI Xiao-lu,SU Wei-lian,LI Guo-xia
（International Medical School,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

[Objective]To study the protective effects and mechanism of Fushen Jiangzhuo formula(FSJZ)on renal tubulointerstitial lesion in rats.[Methods]The Mesangial proliferative glomerulonephritis(MsPGN)in rats was produced and through extending the time of the modeling to 20th weeks the model was naturally developed to tubulointerstitial lesion.The rats were divided into 4 groups,including Chinese medicine group,Western medicine positive control group,model group and blank group.FSJZ formula was given to the rats of Chinese medicine group and benazepril was given to Western medicine group,while the same volume of saline was given to the animals in model group and blank group for 20 weeks.We isolated the kidney tissue of the rats at the end of 12,16,20 week and observed the effect of FSJZ on anti fibrosis factors of HGF and BMP-7 in renal tissue by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction and immunohistochemistry method.[Results]The anti-fibrosis factors of HGF and BMP-7 changed in renal tubulointerstitial lesion in rats.Renal tubulointerstitial lesion could significantly down-regulate the expressions of HGF and BMP-7,while FSJZ could significantly up-regulate the expressions of HGF and BMP-7 and antagonize these effects caused by renal tubulointerstitial lesion.[Conclusion]FSJZ has distinct effects of protecting pathological renal interstitial fibroblasts.The mechanism may be related with the regulating effect of FSJZ on mRNA and protein expression of HGF and BMP-7.

Fushen Jiangzhuo formula;renal tubulointerstitial lesion;hepatocyte growth factor;bone morphogenetic protein-7

R692.31

A

1672-1519（2014）12-0748-04

2014-08-20）

（本文編輯：馬 英，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.12.14

天津市自然科學基金項目（No.11JCYBJC12800）。

李春雨（1985-），男，博士，講師，主要從事中藥藥理學研究。

李國霞，E-mail:liguoxia96@163.com。