針刺人中穴對MCAO大鼠中樞神經系統神經干細胞增殖影響的研究*

羅 丁，樊小農，趙海英，齊兆雙，石學敏

（1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸研究所，天津 300193；3.國家中醫藥管理局量效關系三級實驗室，天津 300193；4.國家中醫藥管理局腦病針刺療法重點研究室，天津300193；5.天津市針灸學重點實驗室，天津 300193）

·實驗研究·

針刺人中穴對MCAO大鼠中樞神經系統神經干細胞增殖影響的研究*

羅 丁1，樊小農2，3，4，趙海英1，齊兆雙1，石學敏2，5

（1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸研究所，天津 300193；3.國家中醫藥管理局量效關系三級實驗室，天津 300193；4.國家中醫藥管理局腦病針刺療法重點研究室，天津300193；5.天津市針灸學重點實驗室，天津 300193）

[目的]探討針刺人中穴治療缺血性腦卒中的神經發生機制。[方法]用BrdU+/nestin+免疫熒光雙標和蛋白免疫印跡法觀察針刺對線栓法大鼠大腦中動脈阻斷實驗模型（MCAO）大鼠大腦新生神經細胞及皮質、海馬、紋狀體nestin蛋白表達量的變化的影響。[結果]針刺組MCAO大鼠BdrU+、nestin+和BrdU+/nestin+細胞數均高于正常組、假手術組和模型組（P＜0.05），模型組高于正常組和假手術組（P＜0.05）；針刺組nestin在海馬和皮質的表達量高于其他組別（P＜0.05）。[結論]缺血缺氧能引起MCAO大鼠腦神經干細胞的增殖，而針刺人中穴能增強神經干細胞增殖作用，促進大腦功能的修復。

人中穴；MCAO；神經干細胞；BrdU；nestin

在中國腦卒中是導致成年人致死致殘的主要因素，流行病學研究表明其病死率高達157個人/ 10萬，每年新發患者約250萬，有男性高于女性（1.3~ 1.5∶1）、缺血性高于出血性卒中（43%~79%∶18%~ 47%）的趨勢，給家庭和社會經濟帶來沉重負擔[1]。治療腦卒中的首要目標是提高患者的生存率和生活質量，而傳統觀點認為神經細胞是永久細胞，腦卒中時神經細胞損傷為不可逆損傷。石學敏院士創立的醒腦開竅針刺法對卒中后患者神經功能恢復有很好的效果，但腦內機制尚不明確，因此本研究以針刺人中穴（醒腦開竅針刺法主穴）為切入點，用BrdU/ nestin熒光雙標和蛋白免疫印跡的方法，觀察大鼠大腦中動脈阻斷實驗模型（MCAO）新生神經細胞及鼠腦皮質、海馬、紋狀體nestin蛋白表達量變化，探討針刺治療缺血性腦卒中的神經發生機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 水合氯醛、無水乙醇、二甲苯、濃鹽酸（天津化學試劑廠），4%多聚甲醛溶液（武漢博士德公司），石蠟（上海華永公司），BrdU（Sigma公司），兔抗大鼠Nestin多克隆抗體（Abcom公司），小鼠抗大鼠Brdu單克隆抗體（Millipore Chemicon公司），山羊抗小鼠IgG綠色熒光二抗、山羊抗兔IgG紅色熒光二抗山羊封閉血清工作（上海麥約爾公司），多聚賴氨酸防脫片（北京中杉金橋公司），Bis、Tris、APS、SDS、EDTA、NP-40，Tritonx-100、PMSF、TEMED、異丙醇、BCA kit、GelBlotPapers雜交濾紙，溴酚藍，BCA蛋白定量試劑盒，裂解液，甘油，β-巰基乙醇，PVDF膜（均購于上海生工）。marker(10-250kDa，Fermentas，#SM1811)，顯影液，內參（βactin）二抗（羊抗兔），Nestin山羊抗小鼠HRP標記抗體均購自MILLPORE公司，內參（β-actin）一抗（ 兔 抗 鼠 ，CellSignaling，#4970），Anti-Nestin Monoclonal Antibody購自Thermo公司。

1.1.2 主要儀器 LEICATP1200脫水機、LEICAEG1150H包埋機、LEICAEG1150C冰臺、LEICARM2245切片機、熒光顯微鏡（德國LEICA）；CS-VI型攤片烤片機、TS-1型脫色搖床、HH-W三用恒溫水箱、BT-100恒流泵，電泳儀、轉膜槽（北京六一廠），BioRad凝膠成像系統（BioRad公司），移液器（Eppendorf），Olympus數碼相機（以上均由天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸研究所提供）。

1.2 實驗動物與分組 SPF級Wistar成年健康雄性大鼠40只（260~280 g，軍事醫學科學院），按隨機數字表分為正常組、假手術組、模型組和針刺組（n=10）。實驗操作獲天津中醫藥大學動物倫理委員會批準，所有動物均遵循相關規定進行處理。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備與干預方法 參照Zea-Longa線栓法制備大鼠MCAO模型[2]，大鼠造模清醒后，按Zausinger[3]六分法評定造模成功與否，排除造模后病情過輕或過重的模型（評分為0、4和5分的大鼠）。針刺組大鼠在造模成功清醒后，予針刺人中穴（大鼠鼻中隔下方約1 mm[4]）干預，刺激參數為頻率180次/分，持續刺激5 s，每12 h一次，持續7 d。假手術組：除不插入魚線外操作與手術組相同，并與針刺組相同次數捉抓。

1.3.2 標本取材與制備 每組10只大鼠中，5只用于熒光雙標記、5只用于免疫沉淀檢測大腦海馬、皮質和紋狀體各部nestin蛋白含量。用于檢測熒光雙標記的大鼠于造模24 h后腹腔注射給予BrdU（50 mg/kg），每12 h一次，連續6 d，7 d后4%多聚甲醛灌注取腦固定，24 h后在大腦冠狀位視交叉處切厚約3 mm腦組織切片，依次置于70%、80%、90%、95%、100%乙醇和二甲苯、石蠟中脫水，包埋機中包埋后切成4μm片，用多聚賴氨酸處理的防脫片撈起置于60℃烘片機上烘干備用。用于免疫蛋白質印跡法檢測的大鼠斷頭后取腦冷凍備用。

1.3.3 免疫熒光雙標記法 70℃烤片2 h，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟透明水化組織切片，0.01 mmol/L PBS沖洗3次，檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）微波爐中火5 min兩次進行抗原修復，室溫下冷卻60 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次后在2 mol/L HCl 37℃中解旋30 min，PBS漂洗后用10%山羊血清室溫封閉30min，加Brdu 1∶50、Nestin 1∶100一抗混合液4℃孵育過夜，室溫復溫45 min后加山羊抗小鼠（1∶300）、山羊抗兔（1∶300）避光孵育4 h，75%甘油封片，熒光顯微鏡觀察拍攝，記錄400倍下每個視野中陽性細胞的數量。

1.3.4 免疫蛋白質印跡法 用蛋白酶抑制劑和裂解液（1:50）提取各組海馬、皮質、紋狀體的總蛋白，分裝于-80℃冰箱中保存，用BCA蛋白試劑盒進行蛋白定量，定量后的蛋白樣品分別經8%和10%聚丙烯酰胺凝膠（均用丙烯酰胺、tris、SDS、APS、TEMED制備）20 mA電泳。在傳膜槽中轉膜，將轉膜后的PVDF膜放入5%牛奶封閉液中封閉1 h，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）漂洗3次后加3 mL一抗小鼠抗大鼠（1∶3 000）密封4℃過夜，漂洗后加二抗羊抗鼠HRP（1∶4 000）室溫中搖動反應,加化學發光檢測試劑，用Biorad凝膠成像系統顯影。

1.4 統計方法 用SPSS18.0軟件包對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，正態分布計量資料的組間比較采用單因素方差分析，偏態分布計量資料的組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 實驗結果

2.1 針刺對神經干細胞增殖的影響 免疫熒光雙標記法觀察各組大鼠腦片，正常組和假手術未見免疫陽性細胞，模型組和針刺組可見免疫陽性細胞，主要分布于缺血皮質及紋狀體、半暗帶周圍，其中針刺組陽性細胞數高于模型組，表明缺血缺氧能誘導神經干細胞增殖，而針刺人中穴能增強缺血缺氧后神經干細胞增殖作用（見表1、圖1）。

表1 針刺對神經干細胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effect of acupuncture on the proliferation of neural stem cells（±s） 個/視野

表1 針刺對神經干細胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effect of acupuncture on the proliferation of neural stem cells（±s） 個/視野

注：與正常組相比，*P＜0.05；與假手術組比較，#P＜0.05；與模型組相比，○P＜0.05；與針刺組相比，☆P＜0.05。

組別 n BrdU+nestin+BrdU+/nestin+正常組 5 0○☆0○☆0假手術組5 0○☆0○☆0模型組 5 8.80±1.30*#☆4.60±0.89*#☆0針刺組 5 26.20±6.76*#○10.40±1.14*#○2

2.2 針刺對大鼠海馬、皮質、紋狀體nestin蛋白表達的影響 7 d后，模型組、針刺組大鼠海馬、皮質的nestin表達蛋白均增加（P＜0.05），紋狀體雖無統計學意義，但也表現出了增加的趨勢，說明缺血能誘導大腦nestin蛋白的表達，而針刺能增強nestin蛋白的表達（見表2）。

表2 針刺對大鼠海馬、皮質、紋狀體nestin蛋白表達的影響（±s）Tab.2 Effects of acupuncture on the expression of nestin protein in cortex,hippocampus and striatum（±s）bit

表2 針刺對大鼠海馬、皮質、紋狀體nestin蛋白表達的影響（±s）Tab.2 Effects of acupuncture on the expression of nestin protein in cortex,hippocampus and striatum（±s）bit

注：與正常組相比，*P＜0.05；與假手術組比較，#P＜0.05；與模型組相比，○P＜0.05；與針刺組相比，☆P＜0.05。

組別 n 海馬 皮質 紋狀體正常組 5 01.62±0.58 1.56±0.55 1.39±0.29假手術組 5 01.44±0.87 1.81±1.09 1.34±0.47模型組 5 07.32±12.92*#☆2.75±1.36*#2.07±2.25針刺組 5 15.61±23.50*#○4.67±1.20*#2.84±2.19

圖1 針刺對神經干細胞增殖的影響Fig 1 Effect of acupuncture on the proliferation of neural stem cells

3 討論

神經干細胞是存在于成年哺乳動物中樞神經系統內、具有增殖和分化功能的一類細胞[5]，缺血性腦卒中能誘發腦內神經干細胞的增殖、分化與轉移[6-7]，從而實現大腦的自我修復，減少缺血缺氧造成的損害，使治療腦卒中后神經功能損傷成為可能。研究表明，神經干細胞在正常鼠腦中主要以靜息的狀態存在于室管膜下層（SVZ）[8]和海馬齒狀回區（DG）[9]，這些內源性的NSCs在一定條件下如缺血缺氧、外傷等，可被激活、并分化為神經細胞和膠質細胞，參與新神經功能環路形成，從而促進神經功能的恢復。

BrdU是胸腺嘧啶脫氧核苷的類似物，因其能在S期進入細胞核內參與細胞分裂多用于標記包括神經細胞、少突神經細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞等在內的各種新生細胞。nestin是在廣泛存在于胚胎期神經細胞中、并在哺乳動物中樞神經神經系統發育過程中一過性表達的特異性第Ⅵ類中間絲蛋白，是神經細胞的標志性抗原，多用于監測神經干細胞的增殖情況。

醒腦開竅針刺法是經過幾十年臨床應用、已證明了的對缺血性腦卒中患者神經功能與生活質量有較好療效的治療方案[10]。筆者的前期研究表明，醒腦開竅針刺法能通過上調c-fos[11]和CaN[12]基因的表達，建立腦梗死后的側枝循環[13]，抑制海馬神經元細胞Ca2+[14]超載，改善局部微循環[15]和維持缺血后正常神經細胞數量[16-17]，從而實現MCAO大鼠行為學、梗死率等指標的改善[18]。本研究中，通過對神經干細胞數量和MCAO鼠大腦海馬、皮質、紋狀體的nestin蛋白表達量的觀察，發現經MCAO造模后的模型組、針刺組無論在BrdU+、nestin+，還是nestin蛋白表達量上，均高于正常組和假手術組（P＜0.05），表明大腦中動脈阻塞造成的缺血缺氧可誘導成年鼠大腦中的NSCs的增殖，這與國內外學者的研究結果[6,19-21]一致，而針刺組上述指標的表達又高于正常組、假手術組和模型組（P＜0.05），表明針刺人中穴能促進缺血皮質及海馬、半暗帶周圍NSCs的增殖，增殖的膠質細胞或神經細胞對MCAO后神經發生有正性調節的作用。故醒腦開竅針刺法治療缺血性腦卒中獲效的機制可能與人中穴促進神經干細胞增殖、分化和成活，以維持正?！肮ぷ鳌钡纳窠浽獢盗坑嘘P。

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Study on the effect of acupuncturing Renzhong on proliferation of neural stem cells in central nervous system of MCAO rat

LUO Ding1,FAN Xiao-nong2,3,4,ZHAO Hai-ying1,QI Zhao-shuang1,SHI Xue-min2,5
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.The Acupuncture and Moxibustion Institute of the First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;3.Three-level Laboratory of dose-effect relationship of the State Administration of TCM,Tianjin 300193,China;4.Tianjin Acupuncture Key Laboratory of the State Administration of TCM,Tianjin 300193,China;5.Acupuncture Encephalopathy Key Research Laboratory of the State Administration of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To discuss the mechanism of treating ischemic stroke by acupuncturing Renzhong.[Methods]We observed the population of BrdU+/nestin+cells and expression of nestin protein in cortex,hippocampal and striatum in MCAO rat by double-labeling immunofluorescence and Western blot.[Results]Renzhong group’s population of BdrU+,nestin+and BrdU+/nestin+cells were significant higher than that in normal group,sham group and control group in brain of MCAO rat（P＜0.05）.Renzhong group also had the highest expression of nestin protein in cortex and hippocampal（P＜0.05）.[Conclusion]Acupuncture of Renzhong can enhance the proliferation of NSCs in central nervous system of MCAO rat.

Renzhong；MCAO；NSCs；BrdU；nestin

R223.11

A

1672-1519（2014）09-0548-04

2014-03-18）

（本文編輯：馬 英，張震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.09.12

國家重點研究計劃（973）項目（2010CB530506）；天津市科委項目（10JCBJC12700）。

羅 丁（1985-），女，博士研究生，研究方向為針刺治療腦卒中的機制研究。

樊小農，E-mail：fanxiaonong@163.com。