左炔諾孕酮納米載藥緩釋復合材料對人精子活力及超微結構的影響*

劉凱峰魏 勉呂 芳錢 陽顧方樂王 品嵇玉蓉張曉梅**

1. 江蘇省蘇北人民醫院, 揚州大學臨床醫學院生殖醫學中心 （揚州 225001）; 2. 揚州大學化工學院

左炔諾孕酮納米載藥緩釋復合材料對人精子活力及超微結構的影響*

劉凱峰1魏 勉1呂 芳1錢 陽2顧方樂1王 品1嵇玉蓉1張曉梅1**

1. 江蘇省蘇北人民醫院, 揚州大學臨床醫學院生殖醫學中心 （揚州 225001）; 2. 揚州大學化工學院

目的研究左炔諾孕酮納米載藥聚乳酸（PLA）-聚苯乙烯（PS）復合材料對人精子活力及超微結構影響。 方法 正常生育男性精液，經密度梯度離心處理后分為空膜組、載藥膜組和正常對照組，分別與PLA-PS復合生物膜（空膜）、左炔諾孕酮納米載藥PLA-PS復合生物膜（載藥膜）共培養24h，以未加膜培養的精子作為對照，計算機輔助精液分析（CASA）檢測精子活力，透射電鏡下觀察各組精子超微結構的變化。結果（1）共培養24h后各組間精子活力差異無明顯統計學意義（P＞0.05）；（2）空膜組精子的超微結構與對照組無明顯差別；（3）載藥膜組精子的頂體波浪狀改變，頂體缺損或消失，質膜溶解，線粒體空泡樣變，凋亡精子及崩解精子與空膜組及對照組比較明顯增加。結論 PLA-PS復合材料本身對人精子活力及超微結構無明顯影響，加入左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復合材料可使精子超微結構改變，促進精子凋亡，為左炔諾孕酮納米載藥PLA-PS復合材料作為一種安全有效的新型生物可降解納米載藥宮內節育系統提供了進一步的實驗依據。

納米醫學; 左炔諾孕酮; 精子; 避孕

左炔諾孕酮納米載藥緩釋復合材料已為廣大有避孕要求的女性帶來新的選擇。納米載藥緩釋復合材料具有不改變藥物性狀，減少藥物的使用量、降低藥物毒副作用、增加藥物的穩定性、可提高作用時間和效果、可有效避免降解核苷酸的作用等優勢。研究發現將納米粒子復合于生物材料中利于納米粒子的載藥、緩釋等性能[1]。有研究報道左炔諾孕酮聯合十一酸睪酮可抑制精子的生成[2]，但左炔諾孕酮納米載藥緩釋復合材料對男性精子的活力及精子細胞超微結構的影響還沒有相關文獻報道。本研究探討左炔諾孕酮納米載藥聚乳酸（PLA）-聚苯乙烯（PS）復合材料對人精子活力及超微結構影響，以進一步研究生物可降解納米載藥緩釋宮內節育系統的構建，為其作為新型避孕系統提供實驗依據。

材料與方法

一、左炔諾孕酮納米載藥材料的制備

將PLA、PS及載有左炔諾孕酮納米顆粒的PS在真空干燥箱，60℃的條件下干燥12h；將45g PLA和5g PS或5g 載有左炔諾孕酮納米顆粒的PS加入Haake轉矩流變儀進行共混，熔融共混溫度為180℃，時間為8min；在170℃、10MPa的條件下用平板硫化儀將復合材料壓成片材[3]。

二、人精子懸液的制備

3名精液質量正常的男性，禁欲3～7d后手淫法留取精液于無菌取精杯中，液化后充分混勻，采用密度梯度離心法處理精液，即取1.5mL 80% SpermGrad（Vitrolife）加人錐形離心管內, 用無菌巴斯德吸管緩慢于其液面上方加入1.5mL 40% SpermGrad，將2.0mL精液加至密度梯度上部，400×g，離心15min，將管底精子沉淀吸于5.0mL 試管內，加入3.0mL IVF精子洗滌液，重懸洗滌，200×g，離心6min，去除上清液，精子沉淀加入IVF精子處理液制備成5×107/mL密度的精子懸液待用。

三、左炔諾孕酮納米載藥緩釋材料與精子共培養

每份精子懸液分為空膜組、載藥膜組和正常對照組，每組200μl。無菌條件下將PLA-PS復合材料（空膜）及左炔諾孕酮納米載藥PLA-PS復合材料（載藥膜）剪成1mm×1mm大小，分別取20片置入200μl 精子懸液中，即為空膜組和載藥膜組，以未添加復合材料的精子為空白對照，37℃ CO2培養箱孵育24h 后，用計算機輔助精液分析（CASA）檢測精子活率及活力，每組重復3次。

四、精子的透射電鏡檢測

取孵育24h 后的各組精子，1000rmp 離心5min。棄上清液，將沉淀物用2.5%戊二醛固定。 常規電鏡包埋切片，觀察。每組精子做50個縱切（精子頭部能見典型核型態）和50個橫切（精子尾部見典型軸絲結構）。

五、統計學方法

結 果

一、左炔諾孕酮納米載藥復合材料對人精子活力的影響

空膜組、載藥膜組精子活動率（A+B+C級精子）與對照組相比，差異無明顯統計學意義（P＞0.05），空膜組、載藥膜組精子活力（A級精子+B級精子）與對照組相比，差異也無明顯統計學意義（表1），說明PLA-PS復合材料及左炔諾孕酮納米載藥PLA-PS復合材料對精子活率及活力無明顯影響。

表1 左炔諾孕酮納米載藥緩釋材料對人精子活率及精子活力的的影響

二、左炔諾孕酮納米載藥復合材料對人精子超微結構的影響

對照組精子：外形正常，結構完整, 雙層膜性結構和赤道板清晰, 頂體內含物電子密度中等；核呈梨狀形，核染色質電子密度均勻；尾部線粒體分布規則, 大小形態較一致，微管結構完好。空膜組精子超微結構較對照組無明顯變化（圖1）。載藥膜組精子頂體波浪狀改變，頂體缺損或消失，質膜溶解，線粒體空泡樣變, 凋亡精子及崩解精子明顯增加（圖2）。

圖1 正常精子和空膜組

圖2 載藥膜組

討 論

聚乳酸（PLA）是一種具有優良的生物相容性和可生物降解性的合成高分子材料，具有無毒、無刺激、可塑性好、易于加工成型不污染環境等優點，已被美國食品醫藥局（FDA）批準，可用作醫用手術縫合線、注射用膠囊、微球及埋植劑等。將PLA作為納米微粒載藥材料應用于臨床也是近年來研究熱點[4,5]。但因其親水性差、強度低、脆性高、熱變形溫度低、抗沖擊性差、降解周期難以控制、價格貴，目前通過增塑、共聚、共混和復合等改性方法來改進PLA的力學性能，從而更好地滿足生物醫用以及環保的應用。聚苯乙烯（PS）具有高強度、成本低等優點，本研究將PLA和PS按9:1的質量比共混合成生物膜，達到了環保和力學性能的平衡。左炔諾孕酮是目前應用較廣的避孕藥[6]，是一種強效孕激素，主要作用于下丘腦和垂體，使月經中期FSH和LH水平的高峰明顯降低或消失，可以抑制排卵并阻止孕卵著床，同時使宮頸黏液變稠阻礙精子穿透，其在女性避孕方面是對子宮內膜的局限性作用，是可逆的，卵巢分泌激素不受影響[7]。本研究制備了左炔諾孕酮納米載藥緩釋PLA-PS復合材料，并觀察其對男性精子的活力及精子細胞超微結構的影響。

精子頂體因含有透明質酸酶、頂體蛋白酶、神經酰胺酶等，在受精過程中有重要的作用[8]。本研究制備的PLA-PS復合材料本身對人精子活力及超微結構無明顯影響，證實了該復合材料的生物安全性，而左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復合材料可使精子頂體波浪狀改變，質膜溶解，頂體缺損或消失，提示左炔諾孕酮能損壞精子頂體，使精子頂體中所含的各種酶丟失，從而喪失受精能力。

精子中的線粒體通過呼吸底物氧化磷酸化作用產生能量，糖酵解可以通過底物水平磷酸化提供額外的能量，支持人類精子的運動[9]。本研究制備左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復合材料可使精子線粒體發生空泡樣變,理論上可影響琥珀酸脫氫酶（SDH）及乳酸脫氫酶（LDH）的供能，使ATP產生受阻，精子細胞的前向運動能力下降。但本研究發現左炔諾孕酮納米載藥PLA-PS復合材料對精子活力無明顯影響，可能與樣品例數少，作用時間，作用方式有關，有待增加樣品例數和增加作用時間，進一步研究。

構成精子鞭毛的軸絲復合體包含9根雙聯微管，成圓形排列，通過連接蛋白相互連接，并通過放射輻與一對中央微管上中央鞘相連接，各對二聯體微管之間的相對滑動引起尾部的擺動，依靠水解ATP以供給能量[9]。本研究未發現左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復合材料對精子細胞的9+1軸絲結構有影響。

由本研究結果示左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復合材料可使精子頂體異常，質膜溶解，線粒體空泡樣變，促進精子凋亡。為左炔諾孕酮載藥PLA-PS復合材料作為一種新型的宮內節育系統運用于臨床提供研究基礎。但這僅是從細胞形態學上觀察左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復合材料的作用，若進一步揭示作用機制，仍需進一步研究，如研究左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復合材料對精子細胞線粒體內氧化磷酸化過程的影響等。

1 嵇玉蓉, 魏勉, 張曉梅. 生物可降解納米載藥緩釋宮內節育系統的構建及應用前景. 中國醫藥導刊 2012; 14 (12): 2025-2027

2 劉思天, 桂幼倫, 林翠紅, 等. 左炔諾孕酮(LNG)配伍十一酸睪酮(TU)對精子生成抑制差異的研究. 中國計劃生育學雜志 2003; 11(12): 734-738

3 張曉梅, 王大新, 呂芳, 等. 生物可降解納米載藥緩釋宮內節育器及其制備方法:中國.201310008740.5[P].2013-4-17

4 Chen CK, Law WC, Aalinkeel R,et al. Biodegradable cationic polymeric nanocapsules for overcoming multidrug resistance and enabling drug-gene co-delivery to cancer cells.Nanoscale2014; 6(3): 1567-1572

5 Zhang C, Chen J, Feng C,et al.Intranasal nanoparticles of basic f broblast growth factor for brain delivery to treat Alzheimer's disease.Int J Pharm2014; 461(1-2): 192-202 6 Beasley A, Schutt-Ainé A. Contraceptive procedures.Obstet Gynecol Clin North Am2013; 40(4): 697-729

7 張莉嘉, 翁梨駒. 左炔諾孕酮宮內系統臨床使用五年的安全性研究. 中華婦產科雜志 2001; 36 (11): 675-677

8 張蘊暉, 汪玉寶, 李衛華, 等. 苯扎溴銨對人精子細胞超微結構的影響. 環境與職業醫學 2002; 19(2): 71-73

9 李宏軍, 李漢忠. 男科學-男性生殖健康與功能障礙(第3版). 北京大學醫學出版社, 2013: 62

（2014-01-20收稿）

Effects of sustained-released levonorgestrel nanoparticle composites on human sperm motility and ultrastructure*

Liu Kaifeng1, Wei Mian1, Lv Fang1, Qian Yang2, Gu Fangle1, Wang Pin1, Ji Yurong1, Zhang Xiaomei1**
1.Northern Jiangsu People's Hospital, Clinical College of Yangzhou University, Reproductive Medicine Center, Yangzhou 225001, China; 2.Chemistry and chemical engineering college of Yangzhou university

Zhang Xiaomei, E-mail: zhangxiaomeiyz@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of levonorgestrel-loaded nanoparticle composites on human sperm motility and ultrastructure.MethodsSemen samples from normal reproductive males were collected anddivided into empty biofilm (polylactic acid-polystyrene composite biofilm) group, drug-loaded biofilm(levonorgestrel-loaded nanoparticle polylactic acid-polystyrene composite biofilm) group and normal control group. After co-culture with empty biof lm or drug-loaded biof lm for 24 hours, sperm motilityand sperm ultrastructure were detected by CASA and transmission electron microscope respectively.Results(1) No signif cant differences were observed in sperm motility among groups. (2) Compared with that of the control group, no obvious difference in sperm ultrastructure was found in empty biof lm group. (3) Remarkable differences were observed in drug-loaded biof lmgroup such as wavy change, defect or disappearance of acrosome, plasma membrane dissolved, vacuolar degeneration of mitochondria, as well as a signif cant increase in sperm apoptosis and disintegration of sperm.ConclusionPolylactic acid - polystyrene composites itself has no effects on human sperm motility and ultrastructure, levonorgestrel-loaded nanoparticle polylactic acid-polystyrene composites has obvious effect on human sperm acrosome, plasma membrane, mitochondria and promotes sperm apoptosis, which provides the theoretical basis for further study of biodegradable sustained-released nanoparticle drugloaded intrauterine contraceptive system.

nanomedicine; levonorgestrel; spermatozoa; contraception

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.05.002

R 979.2

資助: 國家自然科學基金青年基金項目（81100421）; 江蘇省科技支撐計劃-社會發展項目（BE 2010698）
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, E-mail: zhangxiaomeiyz@163.com