胰島素控制血糖對糖尿病大鼠陰莖勃起功能障礙的防治*

田文杰王 林李輝喜雷洪恩關瑞禮許永德那萬里**辛鐘成**

1. 吉林大學中日聯誼醫院泌尿外科（長春 130033）; 2. 北京大學第一醫院泌尿外科

·論 著·

胰島素控制血糖對糖尿病大鼠陰莖勃起功能障礙的防治*

田文杰1王 林2李輝喜2雷洪恩2關瑞禮2許永德2那萬里1**辛鐘成2**

1. 吉林大學中日聯誼醫院泌尿外科（長春 130033）; 2. 北京大學第一醫院泌尿外科

目的觀察利用胰島素嚴格控制血糖對糖尿病性勃起功能障礙（DMED）防治效果。方法 年齡8周的健康Sprague-Dawley（SD）大鼠，STZ腹腔注射誘導糖尿病，監測血糖兩個月誘導DMED模型，分正常對照組（NC），糖尿病安慰劑治療組（DM），糖尿病胰島素治療組（DM-Inshulin）胰島素每次2～6個單位，一天2次腹腔注射，連續治療4周，早晚監測血糖。治療結束后檢測陰莖海綿體神經刺激下陰莖海綿體內壓與平均動脈血壓（ICP/MAP）評估勃起功能。留取陰莖組織進行組織學檢測。結果DM-Insulin組大鼠血糖和糖化血紅蛋白得到有效控制，雖然勃起功能（以ICP/MAP檢測）比較DM 組有所改善，但是比較NC組顯著降低。DM-Insulin組大鼠陰莖海綿體內皮細胞標記物vWF、平滑肌等組織學病理變化及組織細胞凋亡指數比較DM組顯著改善，但仍未恢復至NC組水平。結論糖尿病大鼠利用胰島素嚴格控制血糖水平，可部分改善陰莖勃起功能和陰莖海綿體病理變化，但是不能完全修復勃起功能障礙的病理變化，這可能與糖尿病糖基化終末產物及其受體（AGE-RAGE）相關代謝記憶有關，有待于進一步深入研究。

勃起功能障礙; 糖尿病; 胰島素

據調查顯示40～70歲男性中有52%受勃起功能障礙（Erectile dysfunction，ED）的困擾，其中接近50%表現為器質性勃起功能障礙，其涉及勃起神經病變、陰莖海綿體損傷性病理變化及內皮細胞損傷等[1]。ED是糖尿病（Diabetes mellitus，DM）的常見早期并發癥之一，其患病率為正常男性的3倍[2]。對于糖尿病性勃起功能障礙（DMED）近年來作為廣泛用于勃起功能的治療口服磷酸二酯酶5型抑制劑如西地那非以及陰莖海綿體藥物注射療法效果不佳，嚴重危害生活質量和家庭和諧，常需陰莖起搏器植入手術治療[3]。但昂貴的手術治療費用，使陰莖起搏器植入手術治療在我國顯然無法成為常態化的治療方式，無法滿足大多數患者的治療需求。

傳統觀念認為利用胰島素等藥物有效地控制血糖，且期待能夠防治糖尿病并發癥[4]。但是臨床上糖尿病患者雖然利用胰島素等藥物治療有效控制血糖，但是不能完全防治糖尿病合并癥，而且歐美前瞻性臨床研究結果也觀察到這種結果，但是其機制目前還需要深入研究[5,6]。

DMED的病理學變化涉及高血糖引起糖基化終末產物（AGE）堆積，糖基化終末產物受體（RAGE）表達增加，引起氧化應激反應，導致陰莖海綿體病理變化、內皮細胞功能障礙及神經病變引起ED[7]。

本研究建立糖尿病性ED模型，利用胰島素有效血糖控制，檢測神經刺激下的陰莖勃起血流動力學變化，并通過組織學和分子學改變評估胰島素對陰莖海綿體內皮細胞、平滑肌及細胞凋亡的影響，觀察胰島素對糖尿病性ED的防治效果。

材料與方法

一、實驗試劑及儀器

精蛋白生物合成人胰島素注射液（丹麥諾和諾德公司）；戊巴比妥鈉（北大醫院實驗動物中心提供）；抗AGE，RAGE，內皮細胞標記物（vWF），nNOS抗體（美國Abcom公司）；抗GAPDH抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；免疫組化二抗（福州邁新生物技術開發有限公司）；熒光二抗alexa fluor 594（美國invitrogen life公司）；Messon染色試劑盒（北京羅基生物技術有限公司）；細胞凋亡試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）/脂質氧化產物丙二醛（MDA）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；MP150多導電生理儀（美國Biopac公司）；穩壓穩流定時電泳儀（北京六一儀器廠）；光學顯微鏡（德國Leica公司）；熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

二、動物模型及分組

年齡8周的健康Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，體質量200～250g，由北京大學第一醫院提供。隨機選取10只大鼠為正常對照組（NC組），其余20只大鼠造糖尿病模型，腹腔注射STZ，檢測血糖確認18只成模大鼠后飼養8周。設糖尿病對照組（DM組）9只、胰島素治療組（DM+Insulin組）9只。胰島素每次2～6個單位，一天2次腹腔注射，并早晚檢測控制血糖。治療4周。處死，取材。用0.3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈采血送檢，解剖分離陰莖組織。將部分組織固定在用0.1mol/L的PBS配制的、含有2%甲醛和0.002%苦味酸的固定液中4h，浸泡在30%蔗糖中4℃過夜。另一部分置于凍存管液氮保存。

三、海綿體內壓（ICP）和平均動脈壓（MAP）檢測

戊巴比妥鈉腹腔麻醉后大鼠仰臥位固定在手術臺。備皮、消毒，下腹部正中切口，切開包皮暴露陰莖海綿體，穿刺陰莖海綿體成功后和Biopack電生理儀連接檢測ICP。游離左側頸總動脈，穿刺成功后和Biopack電生理儀連接檢測MAP。游離前列腺后外側，顯微手術鏡下尋找盆神經節，盡量游離陰莖海綿體神經，以多導電生理儀刺激器以10Hz的參數刺激陰莖海綿體神經60秒。記錄ICP和MAP值。

四、SOD和MDA檢測

全細胞蛋白提取試劑盒提取蛋白，檢測蛋白濃度并按實驗分組標記。SOD活性檢測通過WST法（Total Superoxide Dismutase Assay Kit with WST -1）既基于WST-1的顯色反應，通過比色（用酶標儀在450nm測定吸光度）來檢測蛋白樣品中SOD活性，嚴格按試劑盒說明書操作并公式計算。MDA含量檢測通過MDA和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid, TBA）反應產生紅色產物的顯色反應，隨后通過比色法（用酶標儀在532nm測定吸光度）對蛋白樣品中MDA進行定量檢測，嚴格按試劑盒說明書操作并公式計算。

五、組織染色及細胞凋亡測試

石蠟切片（3μm），標記實驗編號；常規脫蠟；PBS清洗后，使用Masson試劑盒。冰凍切片包埋劑（opti-mum cutting temperature compound，OCT）包埋后切片（5μm）。洗掉OCT，PBS清洗后，使用細胞凋亡試劑盒。各項操作規程嚴格按照試劑盒說明書執行。

六、蛋白印跡法測定

全細胞蛋白提取試劑盒提取蛋白，檢測蛋白濃度并按實驗分組標記。將樣品放入鈉十二烷基硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉移到聚偏二氟乙烯膜上，封閉后加入一抗（RAGE 1:200）4℃過夜，次日加入二抗，電化學發光后通過Molecular Analyst圖像分析軟件每條條帶的整合密度值（Integrated density value，IDV）。

七、免疫組化

石蠟切片（3μm），標記實驗編號；常規脫蠟；放入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）中抗原熱修復；0.3%過氧化氫甲醇溶液孵育20min封閉內源性過氧化物酶；滴加正常山羊血清封閉，室溫30min；傾去血清，滴加一抗（AGE與PBS 1:500；nNOS與PBS 1:500）4℃孵育過夜，次日傾去一抗PBS清洗后加入二抗；DAB顯色；蘇木素核染色；脫水，透明，中性樹膠封片

八、免疫熒光

冰凍切片包埋劑包埋后切片（5μm）。洗掉OCT，0.3%Triton-100打孔20min，PBS清洗3次，10%正常羊血清封閉30min，vWF抗體與PBS 1:500混合后4℃孵育過夜，次日傾去一抗加入熒光二抗alexa fluor 594（避光）1h，清洗后染DAPI，封片。

九、統計分析

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，兩組間的差異比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、胰島素治療后對于糖尿病大鼠一般狀態及ICP/MAP的影響

各組間初始體質量和初始血糖差異均無統計學意義（P＞0.05）。與NC組相比，DM組最終體質量顯著降低，與DM組相比較，DM+Insulin組顯著增高且具有統計學意義（P＜0.01），DM+Insulin組與NC組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。DM組最終血糖與糖化血紅蛋白顯著增高，與DM組相比較DM+Insulin組這兩項顯著改善，差異具有統計學意義（P＜0.01）（表1），DM+Insulin組與NC組比較，這兩項差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 胰島素對DMED大鼠體質量、血糖及糖化血紅蛋白的影響

勃起功能檢測以ICP/MAP進行比較，DM組測得ICP/MAP顯著低于NC組（P＜0.01），與DM組相比較，DM+Insulin組明顯增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖1），但DM+Insulin組仍低于NC組（P＜0.01）。

圖1 胰島素治療對DMED大鼠勃起功能（ICP/MAP）影響

DM-1nsulin組大鼠血糖和糖化血紅蛋白雖然得到有效控制達到正常水平，且勃起功能（以ICP/ MAP檢測）比較DM 組有所改善，但是比較NC組顯著降低。

二、胰島素治療對vWF、背神經組織DMED陰莖海綿體nNOS表達及平滑肌的影響

圖2 胰島素治療對DMED大鼠陰莖海綿體vWF、nNOS、平滑肌/膠原比例及細胞凋亡指數

由圖2可見，DM組內皮細胞標記物vWF、背神經組織nNOS及平滑肌/膠原比例表達顯著低于NC組（P＜0.01），與DM組相比較DM+Insulin組增高（P＜0.05），但仍顯著低于NC組（P＜0.01）。細胞凋亡指數與NC組相比，DM組凋亡指數顯著升高，與DM組相比較DM+Insulin組降低（P＜0.05），但仍顯著高于NC組（P＜0.01）。

三、胰島素治療對DMED大鼠陰莖海綿體糖基化終末產物AGE及其受體RAGE表達的影響

由圖3可見，發現與NC組相比，DM組AGE及RAGE表達量顯著增高，與DM組相比較DM+Insulin組下降明顯（P＜0.01），但仍顯著低于NC組（P＜0.01）。

四、胰島素治療對SOD和DMED大鼠陰莖海綿體MDA水平的影響

由圖4可見，與NC組相比，DM組SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著增高（P＜0.01），與DM組相比較DM+Insulin這兩項均有改善（P＜0.05），但尚未恢復到NC組水平（P＜0.01）。

討 論

圖3 胰島素治療對DMED大鼠陰莖海綿體AGE及其受體RAGE表達變化情況

圖4 胰島素治療對DMED大鼠陰莖海綿體SOD活性與MDA含量變化情況

陰莖海綿體平滑肌松弛在陰莖的勃起和勃起維持功能中起主導作用。多種性刺激經過神經-內分泌-血管協調，使陰莖海綿體內血流量增加，平滑肌舒張使血竇內血流量進一步增加，海綿體內壓的增加壓迫白膜下靜脈阻斷血液流出而使陰莖堅硬勃起[8]。勃起功能障礙（ED）的定義是性刺激下陰莖勃起硬度不足以插入陰道或勃起維持時間不足以完成滿意的性生活。前期ED的動物實驗研究表明，利用單次腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導大鼠DM模型，兩月后即引起ED，發現陰莖海綿體內糖基化終末產物堆積、氧自由基增加、平滑肌減少，膠原纖維增多，陰莖海綿體內皮細胞缺失、結構紊亂，出現斷裂，陰莖神經纖維腫脹含量減少，網狀纖維和彈力纖維表達異常等病理變化[4,9]。我們在組織學變化中發現糖尿病過程中糖基化終末產物AGE及其受體RAGE表達顯著增高，且海綿體內皮細胞、神經、平滑肌損傷明顯，平滑肌/膠原比例顯著降低。

過去認為，糖尿病患者利用胰島素等藥物有效控制血糖可防治糖尿病合并癥，糖尿病控制和并發癥試驗（DCCT）、英國糖尿病前瞻性研究（UKPDS）及其后續研究均提示：單純利用胰島素嚴格控制血糖雖然可以使血糖與糖化血紅蛋白達到正常水平，但不足以完全阻斷糖尿病合并癥的發生和進展[5,6,10]。Cho等研究報告嚴格控制血糖可以將ICP/MAP恢復到正常水平，嚴格控制血糖組與正常組相比，凋亡指數無明顯差異[11]。本研究發現，嚴格控制血糖后勃起功能、組織學變化，組織細胞凋亡指數得到部分改善，然而其改善程度只是正常對照組水平的50%左右。并觀察到胰島素治療后血漿血糖水平和糖化血紅蛋白水平雖然得到有效控制，但是不能顯著清除陰莖海綿體組織中AGE/RAGE表達，這與引起氧化應激相關SOD降低，MDA表達增加，引起陰莖海綿體平滑肌／膠原纖維表達比例減少、內皮細胞標記物（vWF）和勃起神經標記物nNOS表達降低，細胞凋亡指數增加等病理變化顯著相關。

自上世紀80年代起，“糖尿病代謝記憶”研究逐漸得到人們重視，目前對糖尿病代謝記憶的發生機制尚未完全了解，相關研究提示可能與糖基化終末產物（AGE）及其受體（RAGE）、氧化應激（ROS）及表觀遺傳學改變等有關[12,13]。因此，控制體內AGE、RAGE、ROS含量有望成為控制糖尿病及其并發癥的重要突破點。Usta等研究表明，單純使用AGE抑制劑ALT-711治療可以逆轉糖尿病引起的ED[14]。近期研究表明，天然藥物淫羊藿中分離的單體淫羊藿苷（Icariin，ICA）、淫羊藿次苷（Icariside Ⅱ，ICA Ⅱ）對高血糖水平下DMED具有防治效果，發現糖尿病大鼠勃起功能均顯著改善，組織AGE、RAGE水平顯著下降，減少細胞的凋亡，降低氧化應激水平，進而逆轉糖尿病性勃起功能障的組織病理改變達到接近正常水平[15]。因此，DMED利用胰島素有效控制血糖的同時配伍使用ICA或ICAII可能更有效地防治DMED。

本實驗結果提示，利用胰島素嚴格控制糖尿病大鼠血糖水平，可部分改善陰莖勃起功能和陰莖海綿體病理變化，但是不能完全防治勃起功能障礙合并癥。這種不完全可逆性病理變化可能與雖然胰島素可以嚴格控制血糖，但是糖基化終末產物AGE及其受體RAGE仍然較高水平存在于陰莖組織中，并誘發氧化應激導致不可逆性內皮細胞功能障礙及神經病變有關，即“糖尿病代謝記憶”現象有關。這提示我們糖尿病過程中在嚴格控制血糖的前提下需要配伍使用AGE清除劑或ICA或ICAⅡ等藥物，可能有效防治或延緩糖尿病合并癥。這有待于進一步深入研究。

1 Shabsigh R, Klein LT, Seidman S,et al. Increased incidence of depressive symptoms in men with erectile dysfunction.Urology1998; 52(5): 848-852

2 Fedele D. Therapy Insight: sexual and bladder dysfunction associated with diabetes mellitus.Nat Clin Pract Urol2005; 2(6): 282-290; quiz 309

3 Israilov S, Shmuely J, Niv E,et al.Evaluation of a progressive treatment program for erectile dysfunction in patients with diabetes mellitus.Int J Impot Res2005; 17(5): 431-436

4 Van Den Eeden SK, Sarma AV, Rutledge BN,et al. Effect of intensive glycemic control and diabetes complications on lower urinary tract symptoms in men with type 1 diabetes:Diabetes Control and Complications Trial/ Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications (DCCT/EDIC)study.Diabetes Care2009; 32(4): 664-670

5 Ratzmann KP. [Therapeutic strategy for type 2 diabetes--clear outcome.Resultsof the United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS)].Fortschr Med1999; 117(5): 45-46

6 Writing Team for the Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. Sustained effect of intensive treatment of type 1 diabetes mellitus on developmentand progression of diabetic nephropathy: the Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications (EDIC) study.JAMA2003; 290(16): 2159-2167

7 Navarrete RV, Munoz JG, Martin LL,et al.Metabolic syndrome and erectile dysfunction.Arch Esp Urol2010; 63(8): 673-678

8 Kirby RS, Lue TF. An atlas of erectile dysfunction (Second edition). International Publishers in Medicine, Science & Technology 2004.

9 Zhou F, Li GY, Gao ZZ,et al. The TGF-β1/Smad/CTGF pathway and corpus cavernosum fibrous-muscular alterations in rats with streptozotocin-induced diabetes.J Androl2012; 33(4): 651-659

10 Chrisholm DJ. The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT). A milestone in diabetes management.Med J Aust1993;159(11-12):721-723

11 Cho SY, Chai JS, Lee SH,et al. Investigation of the effects of the level of glycemic control on erectile function and pathophysiological mechanisms in diabetic rats.J Sex Med2012; 9(6): 1550-1558

12 Zhang L, Chen B, Tang L. Metabolic memory: Mechanisms and implications for diabetic retinopathy.Diabetes Res Clin Pract2012; 96(3): 286-293

13 Lander HM, Tauras JM, Ogiste JS,et al. Activation of the receptor for advanced glycation end products triggers a p21(ras)-dependent mitogen-activated protein kinase pathway regulated by oxidant stress.J Biol Chem1997; 272(28): 17810-17814

14 Usta MF, Kendirci M, Gur S,et al. The breakdown of preformed advanced glycation end products reverses erectile dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats: preventive versus curative treatment.J Sex Med2006; 3(2): 242-250; discussion 250-252

15 Zhou F, Xin H, Liu T,et al. Effects of icariside II on improving erectile function in rats with streptozotocininduced diabetes.J Androl2012; 33(5): 832-844

（2013-12-25收稿）

Protective effects of insulin on erectile function in rats with streptozotocin-induced diabetes*

Tian Wenjie1, Wang Lin2, Li Huixi2, Lei Hong'en2, Guan Ruili2, Xu Yongde2, Na Wanli1**, Xin Zhongcheng2**
1. Department of Urology, China-Japan Union Hospital of Jilin University, Jilin University, Jilin 130033, China
2. Andrology Center, Department of Urology, First Hospital, Peking University

Na Wanli, E-mail: E-mail: nwl_12@163.com; Xin Zhongcheng, E-mail: E-mail: xinzc@bjmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of insulin on eretile dysfunction in a rat model with streptozotocin-induced diabetes.MethodsThe diabetic erectile dysfunction (DMED) rat model was made by injecting the male 8-week-old Sprague-Dawley rats intraperitoneally with vehicle or freshly prepared 60 mg/kg streptozocin, and blood glucose level was measured in the later experiments. Then the rats were divided into three groups: the normal control group (N), the diabetes group (DM) and the diabetes plus insulin therapy group (DM+Insulin). 8 weeks after STZ injection, the DM+Insulin group were treated with 2～6 units of neutral protamine Hagedorn twice a day for 4 weeks through subcutaneous injection. After the f nal treatment, all rats were tested for erectile function by measuring the intracavernous pressure and mean arterial pressure (ICP/MAP), and the penile was harvested for histology study.ResultsAlthough the glycemic level was tightly controlled by insulin in the therapy group, ICP/MAP level was partially restored compared to that of the normal control group, so with the endothelial and smooth muscle contents and apoptosis index.ConclusionInsulin could partially restore the erectile functions and pathology changes in the streptozotocin-induced diabetes rat model. Further studies are needed to investigate the underlying mechanisms in the processes of diabetic erectile dysfunction.

erectile dysfunction; diabetes mellitus; insulin

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.002

R 698.1; R 587.1

資助: 國家自然科學基金資助項目 （編號81270693）

**共同通訊作者: 那萬里, E-mail: nwl_12@163.com; 辛鐘成, E-mail: xinzc@bjmu.edu.cn