肝郁證SD大鼠睪酮及間質細胞水平的實驗研究

張培海李廣森潘俊杰張科莊俞旭君尤耀東吳天浪常德貴*

1.成都中醫藥大學（成都 610072）; 2.成都中醫藥大學附屬醫院泌尿男科; 3.四川眉山市中醫院泌尿科

4.中國人民解放軍第 71中心醫院泌尿科; 5.成都中醫藥大學第二附屬醫院男科

肝郁證SD大鼠睪酮及間質細胞水平的實驗研究

張培海1,2李廣森1潘俊杰3張科莊4俞旭君5尤耀東1吳天浪1常德貴5*

1.成都中醫藥大學（成都 610072）; 2.成都中醫藥大學附屬醫院泌尿男科; 3.四川眉山市中醫院泌尿科

4.中國人民解放軍第 71中心醫院泌尿科; 5.成都中醫藥大學第二附屬醫院男科

目的研究肝郁證SD大鼠血清睪酮（testosterone，T）及間質細胞（Leydig cell）的水平。方法 取6月齡SD雄性大鼠18只，隨機分成兩組：模型組12只，空白組6只。空白組常規飼養，模型組采用自制枷鎖套在大鼠頸部，并用自制的腳鐐束縛其雙后足，連續21d，造成肝郁證模型，造模成功將動物處死，測T水平，光鏡結合圖像分析系統觀察Leydig細胞的顯微結構。結果模型組T水平為（71.41±43.97） ng/ml，空白組T水平為（155.03 ±93.14）ng/mL，兩組比較差異具統計學意義（P＜0.05）；睪丸病理形態示：Leydig 細胞數量模型組為（19.67± 8.70），空白組為（33.17±13.59），模型組數量減少，差異具統計學意義（P＜0.05），且模型組細胞體積變小，細胞核不規則。結論肝郁證可降低SD大鼠T水平和減少Leydig 細胞數量。

肝郁證; 睪酮; 萊迪希細胞; 大鼠, Sprague-Dawley

近年來，隨著社會的發展，男性的生殖能力存在下降的趨勢，不育患者逐年增多，約占育齡夫婦的10%～15%，導致該現象的原因復雜，其中情志因素具有重要的作用，從中醫理論來講多與肝郁相關[1,2]。我們的前期研究表明[3]，肝郁證SD大鼠的生殖功能明顯降低，但其可能機制暫不清楚，故通過對肝郁證SD大鼠的血清睪酮（T）及間質細胞的變化來了解其可能的機制。

材料和方法

一、材料

（一）實驗動物

SD全雄性大鼠，18只，6月齡，體質量180～220g，由成都中醫藥大學動物實驗中心提供（川實動管127號）。實驗期間飼養于室溫（20±3.0）℃，自由攝食全價大顆粒飼料，飲水，馴養1周后使用。

（二）實驗材料

自制枷鎖套；睪酮放射免疫分析試劑盒，購于北京北方生物技術研究所，批號：070520；睪丸組織固定液Bouin's液。

（三）主要儀器設備

GC-1200r放射免疫計數器，科大創新股份有限公司；賽多利斯BP-61型電子天平，德國；OLIMPUS CHC型生物顯微鏡，日本；LDR-4.8C大容量低速冷凍離心機，北京醫用離心機廠。

二、方法

（一）實驗分組

適應性馴養1周后，將18只SD雄性大鼠隨機分為兩組：造模組12只，空白組6只。

（二）造模方法

參照陳小野的造模方法[4]，模型組采用自制頸部枷鎖套在大鼠的脖子上，同時加用自制的腳鐐束縛其雙后足。

（三）飼養方法

模型組每籠1只常規喂養，分別標號；空白組每3只一籠常規喂養，分別標號。每日密切觀察動物情況，隨時調整模具。

三、觀察項目及檢測指標

（一）一般狀態的觀察

自造模日開始，每日定時觀察并記錄大鼠日間理毛、撓癢等活動情況及毛發的光澤、大便、精神狀態等一般狀況。

（二）血清睪酮的檢測

取大鼠股動脈血5ml，4℃冰箱靜置，制備血清2ml左右，保存于-20℃冰箱中待用。采用放射免疫法測定，由我院核醫學科檢測。

（三）睪丸Leydig細胞的觀察

1. 病理切片的制備 取右側睪丸剝離被膜后置于Bouin's液中固定24h。取出修整后，依次用50%→ 70%→80%→90%→95%→100%→100%乙醇梯度脫水，再用二甲苯透明，石蠟包埋，組織切片機上連續切片，厚度4μm，用于HE染色。

2. 病理切片的HE染色 具體步驟如下：（1）取石蠟切片置95%乙醇和乙醚混合液（1:1）中固定15min；（2）流水洗2min，蒸餾水洗1min；（3）蘇木素染液染色5min，水洗后1%鹽酸酒精分化；（4）流水浸洗15min后，伊紅染液染1min；（5）95%乙醇和無水乙醇各浸洗2次，每次1min；（6）苯酚二甲苯（1:3）浸洗5min，二甲苯浸洗2次，每次3min；中性樹脂封片保存。

3. 睪丸Leydig細胞的觀察 取已制備的HE染色片在光鏡下觀察（分別用100倍、200倍）每張片子隨機選取5個視野，用德國萊卡QWIN圖像采集系統采集圖像。分析Leydig細胞數量：隨機選取5個視野（×100倍），計算平均每個視野間質細胞數量。肉眼觀察Leydig細胞大小和Leydig細胞核形態。

四、統計學分析

所有數據均用SPSS13.0軟件包進行處理，各項指標結果用均數±標準差（±s）表示，各組數據先進行正態分布檢驗，組間比較用兩組獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、一般狀態的觀察

模型組7d后，開始出現反應和行為遲緩，皮毛枯黃，眼睛瞇小，有眼眵，糞便干、少、小，倦怠食少，爪甲紫暗，尾巴呈棕紅色，且有鱗片出現。此與陳小野頸部枷鎖造模法7～10d的效果符合，造模大鼠已出現肝郁表現。繼續到第3周，模型組大鼠除上述表現外還出現體質量顯著下降，活動減少，反應遲鈍，籠內貼邊等。

二、大鼠T 水平的表達

空白組T為（155.03±93.14）ng/mL，模型組為（71.41±43.97）ng/mL。與空白組比較，模型組T水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

三、大鼠睪丸間質細胞的表達

空白組間質細胞數目為33.17±13.59，模型組為19.67±8.70。與空白組比較，模型組間質細胞數目減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。

在光鏡下可觀察到空白組睪丸間質細胞成群分布，體積較大，核圓形或橢圓形，位于細胞中央。模型組與空白組相比Leydig細胞數量減少，見圖1。

圖1 兩組大鼠睪丸間質細胞形態比較

討 論

當今社會，競爭激烈，人們的生活壓力逐步增大，男性精液質量呈不斷下降的趨勢，男性不育癥逐年增多，情志因素在男性不育的發病中越來越引起了大家的重視，隨著醫學模式的轉變，人們越來越重視心理及社會因素在疾病發生、發展及轉歸中的作用，同時也更加關注疾病對患者心理狀態及社會功能的影響[5]。

在祖國醫學中情志因素多屬肝郁范疇，且對男性生殖功能的影響早有記載，如明代醫家陳士鐸《石室秘篆子嗣論》中指出“肝氣郁塞，不能生胞中之火，則懷抱憂愁，而陽氣因之不振，或臨爐而興已闌，或對壘而戈忽倒。”充分說明肝氣郁結，疏泄失常是造成男性不育的主要因素。臨床上，對不育證的肝郁患者，采用疏肝解郁為主，臨床療效滿意[6,7]，進一步印證了肝郁證對男性生殖功能具有一定的影響，但其具體機制有待研究。

本實驗研究表明：與空白組相比，模型組血清睪酮水平、睪丸間質細胞數目都較其偏低，且兩組比較差異均具有統計學意義（P＜0.05）。研究初步證實，肝郁證SD雄性大鼠血清睪酮水平降低和Leydig細胞數量的減少可能是導致其生殖能力下降的原因，為臨床上從肝論治男性不育證奠定了一定的理論基礎。

本次實驗由于受到眾多條件的限制，故存在不少問題和不足之處，例如：如能檢測血清游離睪酮水平則能更準確的反映睪酮的變化；如能同時測定間質細胞的凋亡，則能更清楚地了解肝郁證SD大鼠模型對生殖功能影響的機制等等。這些有待于今后改進，從而更深入更全面地探討肝郁證對生殖功能的影響及其機制。

1 馬曉年主編. 現代性病學. 第二版. 北京: 人民軍醫出版社, 2004: 348

2 Shchelochkov AM, Nefedova IF,Chernora SN,et al. The regional indicators of male fertility in the Samara oblast and cansative factors of their alterations.Klin Lab Diagn2012; (8): 25-29

3 張培海, 張科莊, 陳帝昂, 等. 肝郁證對雄性SD大鼠生殖功能影響的實驗研究. 中國男科學雜志 2012; 26(3): 12-14

4 陳小野. 中醫證候動物模型制備方法概論. 上海實驗動物科學 1993; 19(3): 191-193

5 劉西茹, 李尚為, 李蕾. 不育癥患者心理因素及干預措施的研究進展. 生殖醫學雜志 2005; 14(2): 125-128

6 趙麗華, 王衛平. 辨證治療男性不育癥56例. 陜西中醫2004; 25(3): 231-232

7 李鈺琳. 男性不育癥的辨證論治. 河南中醫學院學報2005; 20(4): 50

（2013-11-08收稿）

Study on level of serum testosterone and number of Leydig cell in SD rats suffer from liver depression

Zhang Peihai1,2, Li Guangsen2, Pan Junjie3, Zhang Kezhuang4, Yu XuJun5, You Yaodong2, Wu Tianlang2, Chang Degui5*1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine 610072, China; 2. Urological and Andrology Department, Aff liated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Chengdu; 3. Urological Department, Sichuan Meishan Hospital of Traditional Chinese Medicine; 4. The Chinese People's Liberation Army 371th Center Hospital Urology Surgery; 5. The Second Aff liated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Chang Degui, E-mail: cdg998@sina.com

ObjectiveTo study the level of serum testosterone and the number of Leydig cells of SD rats with Liver depression.Methods18 six-month-old SD male rats were randomly divided into two groups such asthe model group(12 rats), the blank group(6 rats). Rats in the blank group were treated with conventional farming, and rats in the model group with homemade neck yoke and fetters, 21 days later, theywere induced into liver depression model . All rats were killed and their serum testosterone (T) levels were measured and the microstructure of the leydig cells were observed by light microscopy combined with image analysis system.ResultsSerum testosterone levels of the model group and the blank group were (71.41±43.97) ng/mL and (155.03±93.14) ng/mL, there was a signif cant differece between them (P<0.05); Testicular pathological patterns analysis showed that the number of Leydig cells of the model group (19.67±8.70) was obviously lower than that of the blank group (33.17±13.59,P<0.05) and the size of cells was smaller, the nuclei was irregular.ConclusionLiver depression might affect serum testosterone levels and the number Leydig cells thus injuryreproductive function.

Liver depression; testosterone; Leydig cells; rats, Sprague-Dawley

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.004

R 698.2

*通訊作者, E-mail: cdg998@sina.com