SCNN1G基因和IL1B基因多態性與漢族男性先天性雙側輸精管缺如的相關性研究*

彭玉婉程龍飛賀小進楊曉玉王 晶

魏兆蓮1周 平1宋 兵1王彬彬3馬 旭3**曹云霞1**

1. 安徽醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心（合肥 230032）; 2. 合肥市第一人民醫院婦產科; 3. 國家人口計劃生育科研所; 4. 江蘇省人民醫院生殖醫學中心

SCNN1G基因和IL1B基因多態性與漢族男性先天性雙側輸精管缺如的相關性研究*

彭玉婉1,2程龍飛3賀小進1楊曉玉4王 晶3

魏兆蓮1周 平1宋 兵1王彬彬3馬 旭3**曹云霞1**

1. 安徽醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心（合肥 230032）; 2. 合肥市第一人民醫院婦產科; 3. 國家人口計劃生育科研所; 4. 江蘇省人民醫院生殖醫學中心

目的研究非電壓門控鈉離子通道基因SCNN1G以及IL1B基因與先天性雙側輸精管缺如（CBAVD）間的關系。方法通過直接測序和聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RELP）方法檢測基因多態性位點rs5735（SCNN1G基因）和rs3917356（IL1B基因）在109例病例和103例對照人群中的基因型頻率的分布。結果兩個單核苷酸多態性（SNP）位點在病例-對照組中的等位基因、基因型頻率分布差異無顯著性（P=0.2410,P=0.1701 rs5735;P=0.5564,P=0.0959 rs3917356）結論SCNN1G基因（rs5735）、IL1B基因（rs3917356）均未發現與CBAVD之間存在明顯的關聯性。

輸精管/畸形; 囊性纖維化跨膜轉導調節因子; 基因

囊性纖維化（CF）是常見的染色體隱性遺傳病，影響人體多種器官形成[1]。先天性雙側輸精管缺如（CBAVD）是其生殖器表現形式，幾乎95%的男性CF患者都存在先天性雙側輸精管缺如[2]。囊性纖維化跨膜轉導因子（CFTR）是CF的主要致病基因，近年來有些學者研究發現在CF患者中具有相同CFTR基因突變確存在著不同的表型[3]，之后又有些學者推測CBAVD致病基因除了CFTR基因很可能存在其他基因變異[4]。Stanke等[5]報道編碼上皮鈉離子通道（ENaC）γ亞單位的非電壓門控鈉離子通道（SCNN1G）基因與CF表型有相關性。ENaC控制調節上皮細胞的鹽水平衡，共包括3個亞單位：α-ENaC、 β-ENaC和γ-ENaC[6]。ENaC在促進胎肺轉化為成熟肺過程中，起著關鍵的液體平衡調節機制[7]。且ENaC通道蛋白與CFTR通道蛋白在分子水平上有相互關聯[8]，SCNN1G基因多態性位點rs5735和rs5723與CF病發生相關。在非洲CF患者中，也發現了ENaC和CFTR兩個基因的突變[9]。細胞因子白介素1b（IL1B）基因編碼促炎性細胞因子IL1β，是另外一個CF的候選基因[10]。IL1B基因是IL-1家族基因之一。在體外培養的人和小鼠肺上皮細胞中發現IL1B基因在氣道促炎癥信號中起到關鍵作用[11]。進一步發現與IL-1B基因相關SNP（rs3917356）與CF相關[12]。本研究是首次在漢族先天性雙側輸精管缺如人群中檢測SCNN1G基因、IL1B基因的等位基因、基因型頻率的分布情況，以探究其與CBAVD發生的關聯性。

材料與方法

本研究包括病例組109例CBAVD患者和對照組103例健康男性。病例組與對照組來自于安徽醫科大學第一附屬醫院和江蘇省人民醫院生殖醫學中心2010年6月至2012年12月期間男科門診患者。CBAVD患者由至少兩名高年資男科醫生結合生殖器體檢、生殖系統超聲檢查、精液常規及生化檢查和性激素檢查等做出診斷，所有患者行睪丸精子抽吸術（ TESA ）或經皮附睪精子抽吸術（ PESA ）發現成熟精子。全部患者進行Y染色體微缺失，染色體核型（46,XY）檢查分析，均正常。所有參與者均簽署研究知情同意書，并通過安徽醫科大學生物醫學研究倫理委員會審查（編號：2008035）。

一、實驗方法和具體步驟

采用基因組DNA提取試劑盒（Qiagen，德國Hilden）提取外周靜脈血基因組DNA。使用NanoDrop分光光度計（ND -2000，威爾明頓，DE）進行DNA濃度和純度測定并標準化至25～30ng/μL。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCRRFLP）分析和直接測序法檢測SNP位點rs5735和rs3917356。PCR擴增引物分別為：rs5735:5'-TCGCCACCTTCTAGCTGACT-3'（正向），5'-CATCTGGGCTCACTGCAAC-3'（反向），和rs3917356:5'- CGCTTTGGACCTCATCTG -3 '（正向），5'- GGCACACAGCAGGTTAGAG -3'（反轉）。熱循環條件：rs5735:預變性：95℃ 3min，40個循環（變性95℃ 40s，退火 63.1℃ 40s，延伸72℃40s），最后終延伸72℃ 7min；rs3917356：預變性95℃ 3min，40個循環（95℃ 50s，57℃ 50s，72℃55s），終延伸72℃ 7min。rs5735 PCR產物經過Bam HI （ New England Biolabs公司NEB ，北京，中國）酶切37℃ 4h。RFLP產物通過4%瓊脂糖凝膠電泳最終確定CT雜合子基因型三個片段分別為497bp、145bp和642bp，CC純合子為497 bp和145 bp兩個片段，TT純合子為642 bp一個片段。 rs3917356通過直接測序確定基因型。

二、統計學方法

采用SPSS13.0軟件進行統計分析，對CBAVD病例和對照組之間SCNN1G和IL-1B等位基因和基因型頻率進行標準的卡方分析及Hardy-Weinberg平衡（HWE）測試。采用t檢驗和方差分析進行臨床數據比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

表1顯示兩組間年齡、嗜酒與否、體質量指數（BMI）存在統計學差異（P＜0.01），而吸煙與否、吸煙年限、接觸放射線史、左右睪丸體積均未見明顯統計學差異（P＞0.05）。

表2顯示rs5735位點的3種基因型CC、CT、TT及兩種等位基因C、T頻率分布在兩組中無明顯的統計學差異（P＜0.05），rs3917356位點的3種基因型AA、AG、GG及兩種等位基因A、G頻率分布在兩組中亦無明顯的統計學差異（P＜0.05）。

2004年Helve等明確在肺疾病中，所有ENaC 亞單位mRNA表達水平均下降，其中以SCNN1G mRNA表達水平下降最為顯著[13]。囊性纖維化跨膜轉導因子蛋白（CFTR）和ENaC在控制調節氣道表面液體平衡方面起著拮抗性作用，兩者均通過對氣道上皮水和細胞內鈉離子和氯離子分泌和吸收進行調節[14]。2009年Joos等[15]對非洲55例CF患者的SCNN1G等基因進行關聯性分析，推測SCNN1G基因很可能是參與了CF患者的基礎缺陷以及炎癥反應。因此，ENaC蛋白通道是導致CF基礎缺陷的重要調節機制。

表 1 兩組一般臨床資料比較 n(%) （±s）

表 1 兩組一般臨床資料比較 n(%) （±s）

注: 與對照組比較,*P＜0.01;**P＜0.05

項目 對照組(n=103) 病例組(n=109)年齡(歲) 32.80±4.66 29.80±5.01*吸煙是 56(54.37) 56 (51.37 )否 47(45.63) 53 (48.63)吸煙年限 4.62±5.13 4.31±5.29酗酒是 41(39.81) 9 (8.26)*否 62(60.19) 100 (91.74)放射線是 4(3.88) 2 (1.83)否 99(96.12) 107 (98.17)化學物質接觸史是 1(0.97) 1 (0.91 )否 102(99.03) 108(99.09)體質量指數 24.31±3.17 23.14±3.41**右側睪丸體積(mL) 14.88±2.64 15.28±3.21左側睪丸體積(mL) 14.81±2.72 15.17±3.3

表2 兩組rs3917356和rs5735位點基因型分布差異

IL-1B基因被證明在肺部的自發性免疫反應中起到至關重要的作用，2009年Levy等[16]通過對808例CF患者進行IL-1基因多態性檢測，結果發現IL-1B基因有陽性多態性位點（rs1143643、rs1143639），Levy等推測這些陽性位點可能是通過改變銅綠假單胞菌感染的敏感性來影響肺部功能的，同時這些IL-1B基因陽性多態性位點可能引起超敏反應來抵抗感染，其負面的影響即損傷了肺功能。2011年Labenski等[17]繼續探討了IL-1B基因多態性與CF之間的關聯，研究發現rs3917356和rs4848306與CF肺疾病的嚴重性相關，引人矚目的本次研究與2009年Levy等的研究樣本完全不同，基因檢測方法也不同，但是這4個SNPs均在相同的基因片段內，更加確定了IL-1B基因多態性與CF之間有著一定的關聯性。此外，功能分析發現在鼻病毒感染的人鼻上皮細胞（HNECs）中，IL-1β會增加α-ENaC在肺中表達[18]，也可以激活核因子-κB（NF-κB）途徑，以改善氣道細胞CFTR表達量[19]。

依據CBAVD與CF有著共同的遺傳學基礎，我們推測SCNN1G基因及IL1B基因可能同樣與CBAVD有關。我們選取了與CF患者中密切關聯且在中國人群中符合MAF＞0.05的多態性位點rs5735和rs3917356。本研究是首次在中國漢族CBAVD患者中檢測rs5735、rs3917356位點基因頻率分布情況。我們利用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RELP）方法，對最后成功分型的109例病例組和103例對照組進行基因型檢測，結果發現兩位點基因型頻率及等位基因頻率分布在兩組之間均無統計學差異（P＞0.05）。這一結果與既往的研究結果不同[5,17]，我們推測可能原因為：（1）不同人種的基因異質性差異；（2）基因與基因之間的相互作用，SCNN1G、IL-1B和CFTR3個基因間可能存在共同作用的機制導致CBAVD的發生；（3）本研究中樣本數量有限，結果可能存在一定偏倚。在今后的研究中可通過進一步擴大樣本驗證。

綜上所述，本研究首次在漢族CBAVD人群中檢測SCNN1G、IL-1B基因型分布情況，為進一步探究CBAVD致病因素提供線索。

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（2014-03-28收稿）

Association ofSCNN1GandIL1Bpolymorphisms with congenital bilateral absence of the vas deferens in the Chinese Han population*

Peng Yuwan1,2, Cheng Longfei3, He Xiaojin1, Yang Xiaoyu4, Wang Jing3,
Wei Zhaolian1, Zhou Ping1, Song Bing1, Wang Binbin3, Ma Xu3**, Cao Yunxia1**1. Reproductive Medicine Center, Department of Obstetrics and Gynecology, the First Aff liated Hospital of Anhui Medical
University, Hefei 230032, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, the First People's Hospital of Hefei; 3. National Research Institute for Family Planning; 4. Reproductive Medical Center of Jiangsu Province People's Hospital

Ma Xu, E-mail: ADgenetics@gmail.com; Cao YunXia, E-mail: caoyunxia6@126.com

ObjectiveTo investigate whetherSCNN1GandIL-1βpolymorphisms were associated with the development of congenital bilateral absence of the vas deferens (CBAVD).MethodsA total of 222 Han Chinese males, including 109 CBAVD and 103 controls were recruited in the study.IL-1B(rs3917356) and sodium channel nonvoltage-gated 1 (SCNN1G, encoding the ENaC γ-subunit) (rs5735) polymorphisms were analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and direct sequencing.ResultsNo signif cant differences in gene locus frequency of either SNP were found between patients with CBAVD and the control (P=0.2410,P=0.1701 rs5735;P=0.5564,P=0.0959 rs3917356, respectively).ConclusionThese results suggest that SNPs of SCNNIG gene and IL1B gene may not be associated with the development of CBAVD.

vas deferens/abnormalities; cystic f brosis transmembrane conductance regulator; genes

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.002

R 697.25

資助: 安徽高校省級自然科學基金項目（KJ2011Z166）

**共同通訊作者, 馬旭,E-mail: ADgenetics@gmail.com; 曹云霞, E-mail: caoyunxia6@126.com