短時授精后受精率高與受精完全失敗后早補救患者的臨床結(jié)局和精子參數(shù)分析*

周 亮 王錦鳳 肖 露 王 勇 耿 嵐 郝桂琴 張 秦 石江霞 錢衛(wèi)平

北京大學(xué)深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（深圳 518036）

短時授精后受精率高與受精完全失敗后早補救患者的臨床結(jié)局和精子參數(shù)分析*

周 亮 王錦鳳 肖 露 王 勇 耿 嵐 郝桂琴 張 秦 石江霞 錢衛(wèi)平**

北京大學(xué)深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（深圳 518036）

目的分析體外授精（IVF）短時授精中受精率高（受精率＞60%）與受精完全失敗（受精率=0%）早補救卵母細胞胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）患者的臨床結(jié)局和精子參數(shù)，探討IVF失敗的相關(guān)因素。方法對比322例IVF短時授精周期中153例受精率達到60%以上的患者（受精率高組即 A組）與同期接受IVF短時授精發(fā)現(xiàn)受精完全失敗后進行早補救ICSI治療的53名患者（受精完全失敗組即B組）的臨床結(jié)局及其精子參數(shù)。結(jié)果A組與B組各獲卵1 619和393枚，各有133名和47名患者接受了新鮮胚胎移植。兩組間的正常卵裂率分別為98.02%（940/959）和97.70%（254/260），優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為33.51%（315/940）和35.43%（90/254），平均移植胚胎數(shù)分別為2.15±0.39和2.05±0.52，移植日內(nèi)膜厚度分別為（12.99±2.53）mm和（12.38±2.45）mm，胚胎種植率分別為29.41%（85/289）和24.73%（23/93），臨床妊娠率分別為44.36%（59/133）和42.55%（20/47），流產(chǎn)率分別為2.26%（3/133）和2.13%（1/47），繼續(xù)妊娠率分別為41.35%（55/133）和38.30%（18/47），差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。而A組的正常受精率較B組低[65.55%（959/1463）vs 77.61%（260/335）]，同時多原核受精率較B組高[14.56%（213/1463）vs 6.27%（21/335）]，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。A組與B組平均精子密度分別為（74.63±36.05）×106/ mL和（76.97±36.64）×106/mL，前向精子密度分別為（46.02±13.79）×106/mL和（40.63±16.08）×106/mL，正常形態(tài)精子分別為（3.74±1.73）%和（4.21±1.86）%，頂體酶活性分別為（79.18±24.89）uIU和（71.81±32.30）uIU，均存在一定的差異，但是并無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 短時授精后受精率高與受精完全失敗行早補救患者具有接近的臨床妊娠率，但受精率高組較受精失敗行早補救組具有更高的多原核受精率和更低的正常受精率，前向精子密度和精子形態(tài)對受精有重要影響，但是其對受精失敗的預(yù)測作用有限。

精子注射, 細胞質(zhì)內(nèi); 妊娠結(jié)局; 精子

常規(guī)體外授精（in vitro fertilization, IVF）周期中完全失敗的發(fā)生率約為5%～10%[1,2]，給醫(yī)患雙方帶來巨大的精神壓力和經(jīng)濟困難。IVF短時授精結(jié)合早補救卵母細胞胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）方案的實施能在IVF受精完全失敗后挽救該治療周期，并取得較好的妊娠結(jié)局，所以逐漸被廣泛應(yīng)用。

在IVF短時授精早期拆顆粒細胞后，IVF實驗室工作人員能遇到多種情況，最常見的是可見部分兩極體受精卵，表明部分卵母細胞受精了，而進行早補救ICSI的患者往往在早拆顆粒細胞后，觀察不到任何卵母細胞具有兩極體，表明可能IVF完全失敗。本中心進行IVF短時授精治療的患者一般是不孕年限超過4年，或精子密度處于（5～30）×106/mL范圍內(nèi)，或正常精子形態(tài)少于4%，為避免IVF完全失敗而行短時授精方案，現(xiàn)回顧性分析短時授精后受精率高（受精＞60%）與受精完全失敗患者的臨床結(jié)局和精子參數(shù)，希望從臨床上尋找與受精失敗相關(guān)的因素，既能避免受精完全失敗又能防止過度治療。

資料與方法

一、研究對象與分組

回顧性分析2013年1月1日至2014年5月30日期間于我院生殖中心接受IVF短時授精且受精率＞60%的153個周期（A組）和53個短時授精完全失敗早補救ICSI周期（B組）的臨床結(jié)局和精子參數(shù)。患者女方的不孕年限超過4年，或精子密度處于（5～30）× 106/mL范圍內(nèi)，或正常精子形態(tài)少于4%。兩組間患者雙方的年齡、不孕年限、用藥天數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異。助孕前，精液檢查采用WHO精液分析方法進行2次及以上分析，結(jié)果判斷以WHO檢測手冊（第五版）為準。IVF短時授精方案是于精卵共孵育4～6h后拆卵并觀察第二極體排出情況，在精卵共孵育16～18h觀察記錄原核情況。A組和B組各有133名和47名患者接受了新鮮胚胎移植。

二、方法

（一）促排方案

患者前一月經(jīng)周期第21天左右給予促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone agonist, GnRH-a，博福-益普生制藥有限公司，3.75mg/瓶）1.25mg 進行肌肉注射，根據(jù)患者年齡和雙側(cè)卵巢基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)，在月經(jīng)第4～6d開始給予促性腺激素（gonadotropin, Gn）果納酚（默克雪蘭諾有限公司，75 IU/支）2～6支/d。，當2個或2個以上卵泡直徑達18mm時，肌注人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrop, HCG，麗珠集團麗珠制藥廠，2000IU/瓶）10000IU，36～38h后經(jīng)陰道B超指引下取卵。

（二）常規(guī)精液分析和形態(tài)學(xué)檢查

禁欲3～7d后手淫取精，用Markler計數(shù)板進行精液常規(guī)分析，用Diff-Quick法分析精子形態(tài)，采用改良Kennedy法檢測頂體酶活性。

（三）精液處理與體外授精

術(shù)前禁欲3～7d，取卵當日男方以手淫法取精，液化后采用密度梯度離心法+上游法優(yōu)化精子，加精比例為2～4萬條精子/卵。

（四）授精觀察

在精卵共孵育4h后拆去卵周的顆粒細胞并移至新的培養(yǎng)滴，觀察卵是否成熟，是否具有兩極體，卵胞漿形態(tài)等[3]。如4h后觀察到有部分卵子具有雙極體，將其繼續(xù)培養(yǎng)至16～18h后觀察記錄原核情況。如4h未觀察到雙極體，于6h再進行觀察，如發(fā)現(xiàn)有受精卵具有雙極體則繼續(xù)培養(yǎng)，如仍未觀察到卵子具有雙極體就對所有MII卵子實施早補救ICSI并記錄在案。

（五）原核期和卵裂期胚胎觀察

精卵共孵育16～18h后（即取卵后第一天）將胚胎移入卵裂微滴，進行原核觀察，看到兩個清楚的原核即為正常受精，異常受精包括觀察到1個原核和3個或以上的原核，未觀察到原核作為未受精記錄。取卵后第三天觀察卵裂情況，按卵裂期胚胎評分標準評分，主要記錄胚胎細胞數(shù)、碎片率和卵裂球大小是否均等。優(yōu)質(zhì)胚胎的定義為取卵后第三天為7～9個卵裂球，大小基本均等，碎片率低于10%。取卵后第三天行新鮮胚胎移植，根據(jù)形態(tài)學(xué)標準選取2～3個最優(yōu)胚胎進行移植。

（六）確定臨床結(jié)局

移植胚胎14d后行血HCG檢測，結(jié)果為陽性者于移植后35d行B超檢查，如有孕囊即診斷為臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/新鮮移植周期數(shù)×100%；胚胎種植率=B超下觀察到的孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。

（七）統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件中卡方檢驗和獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料及精子參數(shù)比較

共納入對象206例（A組153例，B組53例），其中共計180例行新鮮胚胎移植（A組133例，B組47例）。兩組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone: FSH）、基礎(chǔ)黃體生成素（luteotropic hormone: LH）、基礎(chǔ)雌二醇（Estradiol：E2）、用藥天數(shù)、HCG日FSH、HCG日LH、HCG日E2、移植胚胎數(shù)和移植日內(nèi)膜厚度均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1 兩組一般情況及妊娠結(jié)局分析

二、受精情況、胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局比較

A組和B組各獲卵分別為1 916和393枚，正常受精（2原核）率分別為65.55%和77.61%，多原核受精率分別為14.56%和6.27%，正常卵裂率分別為98.02%和97.69%，優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為33.51%和35.43%。A組和B組分別有133名和47名患者接受了新鮮胚胎移植，胚胎種植率分別為29.41%和24.73%，臨床妊娠率分別為44.36%和42.55%，流產(chǎn)率分別為2.26%和2.13%，宮外孕率分別為0.85%和 2.13%，繼續(xù)妊娠率分別為41.35%和38.30%。其中A組的正常受精率較B組低，但多原核受精率較B組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他比較均無統(tǒng)計學(xué)差異，見表1。

三、精子參數(shù)分析

A組和B組男方平均年齡分別為（34.62± 5.17）歲和（33.84±4.17）歲，平均精子密度分別為（74.63±36.05）×106/mL 和（76.97±36.64）× 106/mL，前向精子密度分別為（46.02±13.79）× 106/mL和（40.63±16.08）×106/mL，正常形態(tài)精子百分率分別為3.74 %和4.21%，頂體酶活性分別為（79.18±24.89）uIU和（71.81±32.30）uIU。A組具有更高的前向精子密度，但是兩組比較并無統(tǒng)計學(xué)差異；兩組間的正常精子形態(tài)和頂體酶活性也無顯著差異，見表2。

表2 兩組精子參數(shù)分析（±s）

表2 兩組精子參數(shù)分析（±s）

t值P值男方年齡(歲) 34.62±5.17 33.84±4.17 0.76 0.45精液量(mL) 3.43±1.25 3.25±1.38 0.73 0.46精子密度(106/mL) 74.63±36.05 76.97±36.64 -0.34 0.74前向精子密度(106/mL) 46.02±13.79 40.63±16.08 1.95 0.053正常精子形態(tài)(%) 3.74±1.73 4.21±1.86 -1.37 0.17頂體酶活性(uIU/106） 79.18±24.89 71.81±32.30 1.25 0.22

討 論

IVF短時授精是指授精后早期將受精卵從精卵共孵育液中移出，拆除顆粒細胞觀察卵母細胞是否具有雙極體并以此推斷其受精與否，因該技術(shù)能成功避免完全受精失敗，同時并沒擴大ICSI指征，所以在業(yè)內(nèi)大受歡迎。也有研究表明短時授精較常規(guī)IVF授精可以使受精卵免受高活性氧（reactive oxygen species, ROS）的影響而提高胚胎質(zhì)量[4,5]。本研究也表明短時授精能避免受精障礙患者IVF失敗并獲得良好的臨床結(jié)局。

一、 短時授精增加IVF受精無障礙患者的多原核受精率

伴隨著短時授精技術(shù)的廣泛使用，在IVF實驗室會遇到了各種不同情況，部分患者短時授精完全失敗，這部分患者是短時授精早補救ICSI技術(shù)的得益者，從以上的數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，早補救后的受精率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率，臨床妊娠率都具有較滿意的效果，同時其多原核受精率，流產(chǎn)率和異位妊娠率也在較低的水平[6]。在應(yīng)用短時授精技術(shù)時，還遇到部分患者，其實際受精能力本無障礙，短時授精早拆顆粒細胞后無需補救ICSI，從上面的數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，這部分患者同樣具有較滿意的正常卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率，但是本研究結(jié)果表明其多原核受精率達14.56%，顯著高于受精失敗早補救ICSI組，其原因是否與短時授精早期拆顆粒細胞操作相關(guān)尚不明了。

二 、精子參數(shù)對IVF短時授精結(jié)果的預(yù)測能力有限

為了既能避免完全受精失敗，又能不過度進行短時授精早拆顆粒細胞，本研究對比分析了短時受精率高組和完全失敗組的各種精子參數(shù)，期望能尋到一定的線索指導(dǎo)臨床工作，研究的結(jié)果顯示兩組間精子密度和總精子數(shù)均相當，A組的前向精子數(shù)較受精失敗組高，但是并無統(tǒng)計學(xué)差異；兩組間的正常精子形態(tài)百分率和頂體酶活性也無顯著差異。在臨床工作中，精子正常形態(tài)百分率和頂體酶活性仍是一個重要的推測受精能力的指標，但是就個體而言，仍有患者具有較高精子正常形態(tài)百分率和頂體酶活性仍然受精完全失敗，同時又有部分患者實際受精無障礙但是其精子正常形態(tài)和頂體酶活性檢測結(jié)果數(shù)值較低。

哺乳動物的自然受精是一個精密而復(fù)雜的生理過程，它包括了精卵識別、頂體反應(yīng)、精子穿過透明帶、精卵質(zhì)膜結(jié)合、卵子皮質(zhì)反應(yīng)和雌雄原核形成等一系列的重要步驟，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能引起IVF受精失敗[7,8]。在輔助生殖技術(shù)治療過程中，精子質(zhì)量參數(shù)具有重要的預(yù)測受精能力的作用，但是在常規(guī)IVF授精和IVF短時授精間界定出明確的界限和指標需要更大樣本量的分析，也是業(yè)界的目標和努力的方向。

1 Mahutte NG, Arici A. Failed fertilization: is it predictable?.Curr Opin Obstet Gynecol2013; 15(3): 211-218

2 Kuczynski W, Dhont M, Grygoruk C,et a1. Rescue ICSI of un-fertilized oocytes after IVF.Hum Reprod2002; 17(9): 2423-2427

3 黃國寧, 孫海翔. 體外受精-胚胎移植實驗室技術(shù). 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2012: 95-115, 163-175

4 Gianaroli L, Fiorentino A, Magli MC,et al.Prolonged sperm-oocyte exposure and high sperm concentration affect human embryo viability and pregnancy rate.Hum Reprod1996; 11(11): 2507-2511

5 Kattera S, Chen C. Short co-incubation of gametes in in vitro fertilization improves implantation and pregnancy rates: a prospective, randomized, controlled study.Fertil Steril2003; 80(4): 1017-1021

6 Liu W, Liu J, Zhang X,et al. Short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI: an optimal strategy for complete fertilization failure after IVF.Hum Fertil (Camb)2014; 17(1): 50-55

7 Vogiatzi P1, Chrelias C, Cahill DJ,et al. Hemizona assay and sperm penetration assay in the prediction of IVF outcome: a systematic review.Biomed Res Int2013; 2013: 945825

8 Katsoff B, Check JH, Mitchell-Williams J. Defective oocytes are not a common cause of unexplained infertility as determined by evaluation of sharing oocytes between infertile donors and recipients.Clin Exp Obstet Gynecol2013; 40(2): 193-195

（2014-08-01收稿）

Clinical outcomes and sperm parameter analysis between patients with high fertilization rate and complete fertilization failure after short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI*

Zhou Liang, Wang Jingfeng, Xiao Lu, Wang Yong, Geng Lan, Hao Guiqing, Zhang Qin, Shi Jiangxia, Qian Weiping**
Department of Reproductive Medicine, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong, China

ObjectiveTo analyze the clinical outcomes and sperm parameters of patents after short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI, and investigate the causes of complete fertilization failure.MethodsAmong 322 short co-incubation of gametes cycles, 153 cases had high fertilization rate (IVF fertilization rate>60%: Group A) and 53 cases had complete un-fertilization and rescued by early ICSI (IVF fertilization rate=0%: Group B). The clinical outcomes and sperm parameters were comparatively analyzed between above two groups.ResultsThe patients in Group A and Group B received (1916 vs 393) eggs, and 133 and 47 patients accepted embryo-transfer in their freshcycles, respectively. There were no signif cant differences in the rates of cleavage[98.02%(940/959)vs 97.70%(254/260)], good quality embryo[33.51%(315/940)vs 35.43%(90/254)], implantation[29.41%(85/289)vs 24.73%(23/93)], clinical pregnancy[44.36%(59/133)vs 42.55%(20/47)], abortion[2.26%(3/133)vs 2.13%(1/47)] and ongoing pregnancy[41.35%(55/ 133)vs 38.30%(18/47)] between two groups. The normal fertilization (2PN) rate in Group A was signif cant lower than that in Group B, and the polyspermy rate was signif cant higher than that in GroupB. The average sperm density (74.63×106/ mL vs 76.97×106/mL), forward movement sperm density (46.02×106vs 40.63×106), normal sperm morphology (3.74% vs 4.21%) and acrosin (79.18 vs 71.81) were difference between above two groups, but the difference was not signif cant.ConclusionThe patients in Group A and Group B presented similar clinical pregnancy rates, but the patients in Group A had higher polyspermy rate and lower normal fertilization (2PN) rate. Forward movement sperm density and sperm morphology showed some effects on fertilization, but accurate prediction of fertilization failure by sperm parameters still needs to be further investigated.

sperm injections, intracytoplasmic; pregnancy outcome; spermatozoa

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.006

R321-33

資助: 為國家自然科學(xué)基金資助（30900817）；深圳市科技計劃項目資助（201302069, JCYJ20120618, ZYC201006180435A）
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, E-mail: qianweiping2014@163.com