北京地區四個規模化豬場的豬鏈球菌病流行病學調查

劉修權 賈澤穎 孫玉芳 劉鄧 郭又春 全炎銘 劉莉如

（北京三元集團畜牧獸醫總站，北京 100192）

北京地區四個規模化豬場的豬鏈球菌病流行病學調查

劉修權 賈澤穎 孫玉芳 劉鄧 郭又春 全炎銘 劉莉如

（北京三元集團畜牧獸醫總站，北京 100192）

本試驗從北京地區四個規模化豬場的74頭疑似豬鏈球菌病的仔豬組織中分離培養獲得56株豬源鏈球菌，并進行了API 20 Strep生化鑒定、16S rRNA基因序列比對和藥敏試驗。試驗結果表明：56株豬源鏈球菌分別屬于糞腸球菌、屎腸球菌、鳥鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、豕鏈球菌和豬鏈球菌，其中以蘭氏D群糞腸球菌為主（23/56，41.07%），其次為蘭氏C群馬鏈球菌獸疫亞種（14/56，25.00%）；對10種臨床常用抗生素均產生了耐藥性，耐藥比例從12.50%至92.86%不等，對紅霉素的耐藥比例最高（52/56，92.86%），對新霉素的耐藥比例最低（7/56，12.50%），且多重耐藥性現象極為嚴峻。

豬鏈球菌病；血清分群；藥敏試驗

豬鏈球菌病（Swine Streptococosis）是由鏈球菌感染引起的豬的一類疫病的總稱，其病原主要包括馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus cqui subsp zooepodemicus），蘭氏分群中的D、E、L群鏈球菌以及豬鏈球菌（Strptococcussuis）[1]。該病分布廣泛，世界各地均有不同程度的流行[2]。我國豬鏈球菌病較大范圍的流行始于1963年廣西省部分地區，而其在20世紀70年代至80年代之間日趨嚴重，許多地方呈暴發流行或地方性流行[3]。后隨著疫苗的研制和推廣，馬鏈球菌獸疫亞種所致豬鏈球菌病的蔓延得到了一定程度的遏制。然而20世紀90年代初，廣東首次報道了2型豬鏈球菌致病[4]，此后多地又陸續報道了該型豬鏈球菌病的發生[5]。

目前，疫苗免疫和抗生素治療是防控該病的主要措施。但由于致病性鏈球菌血清型繁多，各血清型菌株之間缺乏有效的交叉免疫保護[6]，且鏈球菌易產生耐藥性，給疫病的防治帶來了困難。本研究對北京地區四個規模化豬場疑似豬鏈球菌病的仔豬病例進行了組織分離培養，并在此基礎上系統開展了鏈球菌蘭氏血清分群、API 20 Strep生化鑒定、16S rRNA基因序列比對和藥敏試驗等工作，以期探明本病在該地區的流行規律，為針對性地選用疫苗和抗生素防控該病提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

標準菌株引自中國獸醫藥品監察所；API Strep 20生化鑒定試劑條購自法國生物梅里埃公司；7%綿羊血瓊脂培養基購自安圖綠科生物工程有限公司；其他培養基干粉購自英國OXID公司，按說明書自行配制；細菌基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、Taq PCR Master Mix均購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由深圳華大基因科技服務有限公司合成；藥敏紙片購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養

根據臨床癥狀挑選疑似豬鏈球菌病的仔豬病例，剖檢后采集脾臟、淋巴結和關節液等病料，無菌接種于7%綿羊血瓊脂平板，37℃恒溫培養18～24小時，觀察菌落形態。挑取可疑菌落純化培養后保存，以供后續試驗用。

1.2.2 生化鑒定

將純化培養后的可疑菌株接種于胰蛋白胨大豆瓊脂表面培養基（TSA），37℃恒溫培養箱過夜培養，以玻片法進行觸酶試驗。觸酶試驗陽性者，取新鮮純培養物用API 20 Strep生化鑒定試劑條進行生化鑒定，操作方法和判定標準見說明書。

1.2.3 16S rRNA PCR檢測

按細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明，提取細菌基因組DNA。參照參考文獻[7]設計、合成、擴增完整16S rRNA基因的PCR引物，上游引物序列為5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物序列為5′-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3′。

PCR反應體系為：2×Easy Taq PCR Super Mix 25μL，Primer 5和Primer 6（10μmol/L）各1μL，dd H2O 2μL，DNA模板1μL；反應條件為：94℃預變性4分鐘，94℃變性30秒，65℃退火40秒，72℃延伸90秒，擴增35個循環，然后72℃延伸10分鐘，4℃保存。擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，并送至深圳華大基因科技服務有限公司進行測序拼接。將測得序列通過NCBI的Blast檢索系統（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進行同源性分析。

1.2.4 藥敏試驗

根據美國臨床和實驗室標準協會（NCCLS）的操作和判定標準[8]，采用藥敏紙片擴散法（K-B法）對分離到的各菌株進行藥敏試驗。藥敏紙片種類包括：青霉素（P）、氨芐西林（AM）、鏈霉素（S）、慶大霉素（GM）、氯霉素（C）、紅霉素（E）、新霉素（N）、四環素（TE）、諾氟沙星（NOR）及環丙沙星（CIP）。

2 結果與分析

2.1 發病情況

從北京地區四個規模化豬場收集臨床疑似豬鏈球菌病的病例共計74例。所有病例均為保育階段以下的豬只，其中慢性型病例占47.30%（35/74），急性敗血型（敗血癥）病例占18.92%（14/74），腦膜炎型（神經癥狀）病例占9.46%（7/74），混合癥狀的病例占24.32%（18/74）。

2.2 細菌分離和生化鑒定

本試驗共分離到鏈球菌56株，檢出率為75.68%（56/74）。革蘭氏染色鏡檢均為陽性球菌，液體病料涂片和固體培養物經革蘭氏染色鏡檢，可見菌體多為散在狀態，液體過夜培養物多以長鏈狀態存在。在去纖維綿羊血瓊脂平板培養時，菌落溶血狀態不一，表現為α溶血、β溶血或不溶血。觸酶試驗均為陰性，API 20 Strep生化條鑒定后，判定上述菌株均為鏈球菌屬，結果如表1所示：糞腸球菌23株，占41.07%；屎腸球菌8株，占14.29%；馬鏈球菌獸疫亞種14株，占25.00%；堅忍鏈球菌1株，占1.79%；鳥鏈球菌2株，占3.57%；1型豬鏈球菌2株，占3.57%；2型豬鏈球菌1株，占1.79%；豕鏈球菌1株，占1.79%；未能鑒定出的菌株4株，占7.14%。各分離株的生化反應差異較大，且鑒定為同一菌名的細菌之間生化反應也存在一定程度的差異。

表1 鏈球菌分離株統計表

2.3 16S rRNA PCR產物序列比對

對56株細菌的16S rRNA基因進行PCR和瓊脂糖凝膠電泳后，均在1 500 bp處出現特異性電泳條帶。對各擴增子進行測序后，得到序列峰圖，各引物的下游800 bp以內均無套峰或重峰等現象，且信號強度良好，說明測序結果完全滿足后續序列拼接要求。

將各菌株的上游引物測得序列反向互補后，用LaserGene軟件包中的MegAlign子軟件與對應下游引物測得序列進行比對，得到1 500 bp左右的拼接序列。進一步將拼接后的序列通過NCBI的Blast檢索系統與基因庫中所有序列進行同源性比對，同源性高于95%者表明與基因庫中登記菌株屬于相同細菌。結果如表1所示：糞腸球菌23株；屎腸球菌9株；馬鏈球菌獸疫亞種14株；鳥鏈球菌2株；1型豬鏈球菌2株；2型豬鏈球菌1株；7型豬鏈球菌1株；9型豬鏈球菌3株；豕鏈球菌1株。

2.4 藥敏試驗

由表2可知，56株分離株已對臨床上常用的多種抗生素產生了耐藥性，耐藥比例從12.50%至92.86%不等。對紅霉素的耐藥比例高達92.86%，其次為青霉素、鏈霉素、氯霉素、環丙沙星、慶大霉素、氨芐西林、諾氟沙星、四環素和新霉素，耐藥比例分別為87.50%、82.14%、73.21%、57.14%、42.86%、28.57%、26.79%、16.07%及12.50%。

表2 K-B法藥敏試驗結果

3 討論

豬鏈球菌病分布廣泛，世界各地均有不同程度的流行。在我國，該病對飼養密度較大的規模化豬場危害日益嚴重，制約著養豬業的發展。疫苗免疫和抗生素治療是防控該病的主要措施。然而，由于致病性鏈球菌血清型繁多且缺乏有效的交叉免疫保護，再加上細菌耐藥現象日益嚴峻，給該病的防治帶來了困難[9]。北京地區許多規模化豬場時有豬鏈球菌病的發生，為有效防控該病的流行，有必要對該病進行流行病學調查。

本研究從北京地區四個規模化豬場篩選了74頭疑似豬鏈球菌病的仔豬病例，通過組織分離培養獲得56株豬源鏈球菌，并進行了生化鑒定和16S rRNA基因序列比對。所有74頭病例均為保育階段以下的豬只，其中慢性型病例有35頭，占比最高，達47.30%。慢性型的病例臨床上主要表現為關節炎、心內膜炎、化膿性淋巴結炎、皮炎等癥狀，病程多達十幾天至一個多月，癥狀較緩和。綜合生化鑒定和16S rRNA測序比對結果，確定北京地區豬鏈球菌病的病原主要為蘭氏D群鏈球菌（糞腸球菌、屎腸球菌、堅忍鏈球菌和鳥鏈球菌），占60.71%（34/56），其次為蘭氏C群，占25.00%（14/56），這與國內的一些報道結果一致[10]。值得注意的是，本研究中采用API 20 Strep生化鑒定和16S rRNA測序進行結果比對，符合率為91.07%，差異主要表現在5株細菌（表1）。其中，1株細菌API 20 Strep生化鑒定結果為堅忍鏈球菌，而16S rRNA測序結果鑒定為屎腸球菌；4株細菌API 20 Strep未能鑒定出，而16S rRNA測序結果分別為7型和9型豬鏈球菌。由于鏈球菌血清型眾多，不同鏈球菌菌株之間存在表型差異，表現為生化反應譜之間的差異，而16S rRNA基因的核苷酸序列在同種或同型鏈球菌之間高度保守。本試驗結果表明，16S rRNA基因序列測定可以用于豬鏈球菌病病原菌的鑒定。

本研究藥敏試驗結果表明，分離到的鏈球菌對臨床上常用的10種抗生素均產生了不同程度的耐藥性，對紅霉素的耐藥比例高達92.86%，對新霉素的耐藥比例最低，但也達到了12.50%。值得注意的是，56株細菌的多重耐藥現象極為嚴峻和復雜，共有56種耐藥譜。其中，二重和三重耐藥譜各有2種耐藥譜，菌株數各為2株，分別占3.57%；四重耐藥有14種耐藥譜，菌株數為19株，占33.93%；五重耐藥有12種耐藥譜，菌株數為15株，占26.79%；六重耐藥有5種耐藥譜，菌株數為12株，占21.43%；七重耐藥有4種耐藥譜，菌株數為4株，占7.14%；八重和九重耐藥各有1種耐藥譜，菌株數各為1株，各占1.79%。這提示我們應合理使用抗生素，嚴控抗生素的濫用。因此，建議有條件的養殖場在治療前先進行藥敏試驗以選用敏感的抗生素。

綜上所述，豬鏈球菌病對北京地區規模化豬場威脅嚴重，其病原以蘭氏D群鏈球菌為主，且菌株耐藥性問題突出。目前，商品化豬鏈球菌疫苗以C群和2型豬鏈球菌二價聯苗為主，對該病的防控效果有限。因此，如何有效防控豬鏈球菌病的問題亟待深入研究。

[1] 黃子榮,梁發朝.豬鏈球菌病的防治措施[J].畜牧獸醫科技信息,2006（3）：48-49.

[2] 臧瑩安,胡波,頔盧,等.豬鏈球菌及其血清型的PCR檢測[J].仲愷農業工程學院學報,2011,24（3）：9-11.

[3] 丁曉剛,薛小平,田淑琴,等.我國人-豬鏈球菌病研究進展[J].中國預防獸醫學報,2007,29（3）：239-242.

[4] 黃毓茂,黃引賢,余志東,等.2型豬鏈球菌病的初步研究[J].中國畜禽傳染病,1993（5）：1-3.

[5] 姚火春,陳國強,陸承平.豬鏈球菌1998分離株病原特性鑒定[J].南京農業大學學報,1999,22（2）：70-73.

[6] 閆明媚,蘭德松.豬鏈球菌病及其防控對策[J].中國畜牧獸醫文摘,2011,27（3）：111-112.

[7] 代敏,彭成,陳丹丹,等.全自動微生物分析系統和16S rDNA序列分析技術對奶牛乳腺炎病原菌的鑒定[J].畜牧與獸醫,2011,43 （9）：28-32.

[8] CLSI/NCCLS document M100-S15.Performance standardsforAntimiarobialSusceptibilityTesting,Fifteenth Informational Supplement[S].2005.

[9] 張丹俊,胡曉苗,趙瑞宏,等.豬鏈球菌病的危害及綜合防治措施[J].獸醫導刊,2009（8）：18-19.

[10] 馬增軍,李東紅,芮萍,等.冀東地區豬鏈球菌病流行病學調查[J].河北農業大學學報,2006,29（4）：84-87.

S851.38

B

1673-4645（2014）07-0033-04

2014-06-26

北京三元種業科技股份有限公司自立科研課題-豬鏈球菌病病原菌的分離鑒定及其防治研究

劉修權（1985-），男，碩士，主要從事畜禽疫病檢測工作