菱角啤酒發酵條件的研究

梁寶東，魏海香 *，劉 靜，楊永濤，李 俏，牛漢剛

（1.濟寧學院 生命科學與工程系，山東 曲阜 273155；2.西南大學 生命科學學院，重慶 400715）

菱角（Trapa bicornis）又名水栗、菱實，是一年生草本水生植物菱的果實[1]。菱角味甘、性寒，無毒，含有豐富的淀粉、蛋白質、葡萄糖、不飽和脂肪酸、多種維生素及人體必需的氨基酸，礦物質元素和黃酮類化合物含量也較高。黃酮類化合物能有效改善腦血管功能和血液循環，對防治高血壓、動脈硬化、心血管系統疾病有顯著的療效[2]。天然、營養、保健的菱角啤酒具有很大的開發利用價值和良好的經濟效益和社會效益[3]。本實驗在先前初步研究的菱角啤酒的基礎上[4]，為降低菱角啤酒的酒精度，更加適應市場的需要，進一步研究其發酵條件，為菱角保健啤酒的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）APV：鄭州雅大集團有限公司；菱角：市售；啤酒花：煙臺杰諾生物酶有限公司；大麥芽：曲阜三孔金豐麥芽有限公司；α-淀粉酶、糖化酶：棗莊杰諾生物酶有限公司；CaCl2（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；3,5-二硝基水楊酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T6紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；BL-100高速多功能粉碎機：浙江省永康市松青五金工具廠；TDL-60B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司；FA2004N電子分析天平：上海精密儀器有限公司；LY-0.2A/200啤酒釀制設備：山東良友設備有限公司；FCD-2000智能型恒溫鼓風干燥箱：上海瑯玕試驗設備有限公司；PHS-25pH計：上海精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菱角啤酒制備工藝流程[4]

1.3.2 工藝操作要點

菱角汁的制備：用干磨機將脫殼干菱角粉碎，過300目篩，配成質量濃度為20%的菱角粉漿，加入0.2%的CaCl2作為保護劑，用乳酸調整pH值為6.0，以30 U/g干物質加入耐高溫α-淀粉酶，在95 ℃液化80 min。液化結束，冷卻至60 ℃，用乳酸調整pH值為5.0，以150 U/g干物質加入糖化酶，60 ℃糖化2.5 h。菱角汁在85 ℃條件下保持10 min滅酶。快速濾紙進行過濾，得到澄清的菱角汁。

麥芽汁的制備[5-7]：大米與麥芽按1∶3配料。將大米粉碎，過40目篩，細粉超過其質量的70%，按1∶5加水，45 ℃保持10 min，升溫至90 ℃保持20 min，煮沸20 min，備用。麥芽粉碎，皮殼破而不爛，37 ℃保持20 min，升溫至50 ℃保持60 min后升溫至65 ℃，加入大米液糖化至碘液反應完全，升溫至78 ℃，過濾。調整麥芽汁濃度為12°Bx，用乳酸調整pH值為5.2～5.4。麥汁煮沸過程中添加酒花0.08%，煮沸時間為90 min，過濾。

發酵：采用低溫發酵工藝[8-9]，按照試驗方案，將麥芽汁和菱角汁加入發酵罐，接種酵母泥，進行主發酵和后酵，在發酵過程中，定時取樣，測量相關工藝參數變化[10]。

1.3.3 理化指標檢測

氨基酸態氮測定采用甲醛滴定法[11]；pH值測定采用pH計；酒精度測定采用密度瓶法；糖度、原麥汁濃度采用密度瓶法；苦味值采用比色法；泡持性測定采用秒表法；雙乙酰測定采用紫外分光光度法[12]；酵母菌數測定采用血球計數板計數[13]；還原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸法[14-15]。

1.3.4 菱角啤酒感官評價標準

菱角啤酒感官評價標準（滿分100分）見表1。

表1 菱角啤酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of water chestnut beer

2 結果與分析

2.1 酵母菌接種量對菱角啤酒酒精度和還原糖含量的影響

設置酵母菌的接種量為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，菱角汁的添加量為20%，主酵時間6 d，主酵溫度10 ℃，后酵時間13 d，后酵溫度4 ℃。檢測發酵液中還原糖下降曲線和酒精度的變化趨勢，結果見圖1，并進行感官評價。

由圖1可知，發酵液的還原糖降低速率隨酵母菌接種量的增加而增加，酒精度隨接種量的增加而增加，當酵母菌的接種量為0.1%時，發酵結束后殘糖含量較高，酒精度偏低；當酵母菌的接種量為0.9%時，還原糖下降速率快，發酵的高泡期提前，當酵母菌的接種量為0.5%時，殘糖含量和酒精度都比較適中。主酵2～3 d時泡沫最豐富，主酵第4天還原糖含量就達到后酵要求的4.5 g/100 mL左右，后酵時酵母菌數≥7×106CFU/mL，有利于啤酒的成熟[8]。

主酵后期酵母菌提前沉降，影響后期還原糖的繼續發酵。在感官評定方面，酵母添加量為0.1%時，有明顯的甜味，口感不清爽；酵母添加量為0.9%時，啤酒缺少醇厚感，口味較淡薄，啤酒殺口力差。接種量為0.5%時，口味較柔和，殺口力強。綜合理化指標和感官評定，酵母菌的接種量為0.5%時菱角啤酒的發酵條件最佳。

2.2 菱角汁添加量對菱角啤酒酒精度和還原糖的影響

設置菱角汁的添加量為10%、15%、20%、25%、30%，酵母菌的添加量為0.5%，主酵時間6 d，主酵溫度10 ℃，后酵時間13 d，后酵溫度4 ℃。檢測發酵液中還原糖和酒精度的變化曲線，結果見圖2，并對啤酒進行感官評價。

圖2 菱角汁添加量對菱角啤酒還原糖含量（A）和酒精度變化（B）的影響Fig.2 Effect of water chestnut juice addition on reducing sugar content (A) and alcohol content (B) in water chestnut beer

由圖2可知，菱角汁添加量越大，發酵初期發酵液糖度越低，且菱角汁的添加能降低發酵過程中的還原糖降低速率。在相同時間段，菱角汁添加量越大，酒精度越低，影響酵母菌的乙醇代謝。當菱角汁的添加量為15%～20%，進入后酵時，發酵液的還原糖含量在4.5 g/100 mL左右，酒精度在1.54%vol～1.90%vol。菱角汁添加量≥20%時，還原糖下降速率慢，酒精度較低，影響啤酒的品質。

在感官評定方面，菱角汁添加量越大，泡沫越豐富，啤酒的苦味越重。不添加菱角汁的啤酒，入口清香，持久性較差；菱角汁添加量為10%～15%，菱角啤酒苦味較淡，清澈透明，無沉淀物；菱角汁添加量為20%，菱角啤酒的苦味適宜，爽口，口感醇厚，在口中的持久力強；菱角汁添加量為25%～30%，菱角啤酒苦味較重，口感差，沉淀物較多。綜合理化指標和感官評定，菱角汁的添加量為20%時菱角啤酒的發酵條件最佳。

2.3 主酵時間對菱角啤酒還原糖和酒精度的影響

設置主酵時間為4 d、5 d、6 d、7 d、8 d，酵母菌添加量為0.5%，菱角汁添加量為20%，主酵溫度10 ℃，后酵時間13 d，后酵溫度4 ℃。檢測發酵液中還原糖和酒精度的變化曲線，并對啤酒進行感官鑒定，確定最佳主酵時間。在此過程中，控制酵母接種的時間不同，主酵時間長的提前接種，使它們同時進入后酵。不同主酵時間對發酵液中還原糖和酒精度變化的影響見圖3。

圖3 主酵時間對菱角啤酒還原糖含量和酒精度的影響Fig.3 Effect of main fermentation time on reducing sugar and alcohol content in water chestnut beer

由圖3可知，啤酒在發酵過程中，接種12 h后進入發酵的低泡期，發酵液開始產生泡沫，還原糖降低速率較慢。3～4 d為發酵高泡期，泡沫豐富，糖降低速率快。主發酵第5天進入落泡期，糖降速率有所降低，當還原糖含量降到4.5 g/100 mL時，降溫進入后酵，減緩酵母菌的沉降速率。當主酵時間到第6天時，還原糖含量＜4.5 g/100 mL，此時進入后酵，減緩酵母菌沉降的速率，有利于糖的進一步分解和雙乙酰的還原。主酵時間＜6 d時，進入后酵時的殘糖含量較高，發酵液最后的殘糖含量高，酒精度較低，影響啤酒的口味；主酵時間較長時，酵母菌沉降速率快，不利于雙乙酰的還原。

在感官評定方面，主酵時間為4 d時，啤酒甜味較重，口感不爽口；主酵時間為6 d時，口感清爽，無異味；主酵時間為8 d時，啤酒有酸敗味，可能是由于主酵時間長，雙乙酰峰值延后，后期雙乙酰還原不徹底造成的。綜合理化指標和感官評定，主酵時間為6 d時菱角啤酒的條件最佳。

2.4 后酵時間對菱角啤酒還原糖和酒精度的影響

圖4 后酵時間對菱角啤酒還原糖含量和酒精度的影響Fig.4 Effect of post-fermentation time on reducing sugar and alcohol content in water chestnut beer

設置后酵時間為9 d、11 d、13 d、15 d、17 d，酵母菌添加量為0.5%，菱角汁添加量為20%，主酵時間6 d，主酵溫度10 ℃，后酵溫度4 ℃。檢測還原糖下降曲線和酒精度的變化曲線，結果見圖4，并對啤酒進行感官評價，確定最佳后酵時間。

由圖4可知，發酵液進入后酵，酵母菌沉降，發酵液泡沫減少，還原糖下降緩慢。后酵13 d后還原糖、酒精度基本平穩，鏡檢發現發酵液中的酵母數很少。因此，菱角啤酒發酵的后酵時間13 d為宜，周期太長，生產成本增加。

2.5 啤酒中理化指標的變化

綜上所述，菱角啤酒的最優發酵條件為：酵母接種量0.5%，菱角汁添加量20%，主酵時間6 d，后酵時間13 d。在此條件下進行菱角啤酒發酵，檢測發酵液中還原糖，酒精度，雙乙酰的變化，并與不加菱角汁的啤酒中3種物質的含量進行對比，其變化曲線見圖5。

圖5 啤酒中酒精度、還原糖、雙乙酰的變化趨勢Fig.5 Change of alcohol,reducing sugar and diacetyl content in water chestnut beer

由圖5可知，添加菱角汁的啤酒初始還原糖含量低，在發酵過程中糖降速率小，還原糖在主酵3～6 d時下降速率快。發酵結束時添加菱角汁的啤酒中還原糖的含量高于不添加菱角汁的啤酒。隨著發酵時間的增加，啤酒中雙乙酰含量先增大后逐漸降低，且菱角啤酒的雙乙酰含量低，口感清爽。酒精主要是在主酵中后期和后酵前期產生，后酵后期酒精度變化平穩。綜上所述，添加菱角汁啤酒初始還原糖的含量低，發酵結束時的還原糖含量高，酒精度較低，雙乙酰含量略低，菱角中的某些成分可能影響酵母菌的代謝，有待進一步證實。

2.6 產品質量指標

2.6.1 菱角啤酒感官指標

清澈透明，無明顯的懸浮物和沉淀物；起泡性好，泡沫細膩，持續時間長，掛杯持久。具有明顯的菱角味，有酒花香；菱角啤酒口感爽口，苦味值大，殺口力強，無異雜味。

2.6.2 菱角啤酒理化指標

以不加菱角汁的啤酒作為對照，菱角啤酒檢測的理化指標結果見表2。

表2 菱角啤酒的理化指標Table 2 Physicochemical indexes of water chestnut beer

2.6.3 菱角啤酒衛生指標

菌落總數＜50 CFU/mL；大腸桿菌數＜3 MPN/100mL，衛生指標符合GB2758—2012《發酵酒及其配制酒》規定標準。

3 結論

菱角啤酒的最優發酵條件為：酵母接種量0.5%，菱角汁添加量20%，主酵時間6 d，后酵時間13 d。在此條件下，啤酒中還原糖殘留量為1.63 g/100 mL，酒精度達3.52%vol，雙乙酰含量為0.06 mg/L。釀制的啤酒清澈透明，呈琥珀色，無沉淀物。泡沫豐富細膩，持久性長。口感清爽，苦味協調，品質良好，理化及衛生指標符合國家標準。

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