實(shí)驗(yàn)用金黃色葡萄球菌生物被膜體外模型的建立

張全凱，楊公明*，余 銘，杜 冰，呂小麗

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.陽(yáng)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)系，廣東 陽(yáng)江 529500）

生物被膜（biofilm，BF）是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境在固態(tài)表面生長(zhǎng)時(shí)所采取的一種保護(hù)性的群體生活方式。細(xì)菌生物被膜廣泛存在于自然界中，其中金黃色葡萄球菌是較易形成生物被膜的菌種之一，也是食品加工過(guò)程中的重要污染源[1]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種廣泛存在于自然界的革蘭氏陽(yáng)性病原菌。在美國(guó)，金黃色葡萄球菌是第二大食源性病原菌，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒數(shù)量占細(xì)菌性食物中毒的33%[2]。目前，在食品加工中發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌生物被膜存在[3]。生物被膜是自然條件下細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境而形成的與浮游狀態(tài)細(xì)菌相對(duì)應(yīng)的一種保護(hù)型生長(zhǎng)方式，細(xì)菌將細(xì)胞不可逆的嵌入一個(gè)自我分泌的胞外聚合物基質(zhì)中，該基質(zhì)由多糖、蛋白質(zhì)、核酸和芳香族氨基酸組成。生物被膜菌具有不同于浮游菌生長(zhǎng)率和基因表達(dá)的表型，導(dǎo)致生物被膜表面化學(xué)性質(zhì)的變化，因此BF菌對(duì)各種化學(xué)殺菌劑的敏感程度只有浮游菌的1/10～1/1 000，其耐熱性也相應(yīng)增加，對(duì)環(huán)境變化不敏感，感染部位難以徹底清除[4-7]。生物被膜的良好適應(yīng)性可能導(dǎo)致毒力增強(qiáng)，在食品加工過(guò)程中增加了交叉污染的可能性，導(dǎo)致食品污染的風(fēng)險(xiǎn)增加[8-9]。通過(guò)優(yōu)化金黃色生物被膜體外模型，探討各種因素對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響，了解該菌生物被膜形成規(guī)律，為研究金黃色葡萄球菌生物被膜的防治措施提供實(shí)驗(yàn)材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）：廣東省微生物研究所；胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptose soya agar，TSA）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

氫氧化鈉（分析純）：東莞市東旺化玻儀器有限公司；結(jié)晶紫（分析純）：廣州精科化玻儀器公司；瓊脂、胰蛋白胨、大豆蛋白胨：上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

96孔酶標(biāo)板：上海康寧公司；Bio-Rad 680酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Rad公司；SB32000超聲儀：上海第三分析儀器廠；PYX-250S-A型生化培養(yǎng)箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；SHZ-82A全溫震蕩培養(yǎng)箱（臥式）：常州朗越儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與菌懸液制備

將凍干保存的金黃色葡萄球菌接種于TSA培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)基上直徑＞1mm的菌落一環(huán)于無(wú)菌TSB培養(yǎng)基中，37℃條件下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將復(fù)蘇24h的菌種接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)24h，置于超聲儀上重新使菌團(tuán)分散均勻，參照麥?zhǔn)媳葷岱ǎ胮H值為7.3無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）調(diào)整菌懸液細(xì)菌密度約為108CFU/mL。

1.3.2 生物被膜形成與測(cè)定

接入一定量菌懸液于96孔板中，加入TSB培養(yǎng)基，蓋上蓋子，在37℃條件下恒溫恒濕培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)間后棄去96孔板中的培養(yǎng)物，用250μL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.3）沖洗3次，去除培養(yǎng)基和浮游狀態(tài)的細(xì)菌。在孔中加入甲醇250μL加蓋靜置15min，吸除甲醇后在30℃環(huán)境下自然風(fēng)干，固定吸附緊密的細(xì)菌。在每個(gè)孔中加入250μL結(jié)晶紫（1%結(jié)晶紫溶液），靜置染色20min后棄去染色液，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.3）沖洗直至無(wú)色、晾干。在染色的孔中加入250μL、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇脫色，用空白孔以250μL TSB培養(yǎng)基作為空白調(diào)零，測(cè)定595nm波長(zhǎng)處光密度值OD595nm，每孔做3個(gè)平行，取其平均值[10-13]。

1.3.3 金黃色葡萄球菌生物被膜活菌量的測(cè)定

取出培養(yǎng)一定時(shí)間的96孔板，用無(wú)菌磷酸緩沖溶液（pH 7.3）漂洗3次，在無(wú)菌狀態(tài)下用無(wú)菌棉球擦拭培養(yǎng)孔數(shù)次，將棉球轉(zhuǎn)入裝有10mL PBS溶液的試管中，把試管放入超聲儀中，在50Hz頻率下超聲15min，使棉球上的菌團(tuán)分散于無(wú)菌水中。用無(wú)菌磷酸緩沖溶液（pH 7.3）進(jìn)行梯度稀釋后，在TSA平板上37℃培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)，結(jié)果以lg（CFU/mL）表示。

1.3.4 金黃色葡萄球菌生物被膜體外模型實(shí)驗(yàn)

（1）金黃色葡萄球菌生物被膜制備單因素實(shí)驗(yàn)

分別選擇細(xì)菌接種濃度（105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL、1010CFU/mL）、培養(yǎng)基pH（4、5、6、7、8、9、10）、培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）、培養(yǎng)溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃），培養(yǎng)時(shí)間（12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h）5個(gè)因素來(lái)研究其對(duì)金黃色葡萄球菌成膜的影響，通過(guò)結(jié)晶紫染色法測(cè)定光密度值OD595nm，平行試驗(yàn)3次。

（2）二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)

綜合考慮單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定在細(xì)菌接種濃度109CFU/mL、培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的條件下，選擇培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）和培養(yǎng)基pH（C）建立關(guān)于生物被膜活菌數(shù)的三元二次回歸模型，并尋求最優(yōu)相應(yīng)因子水平。二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼如表1所示。

1.3.5 金黃色葡萄球菌生物被膜吸光度與活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

取兩組不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)出的金黃色葡萄球菌生物被膜96孔板，一組用結(jié)晶紫染色法測(cè)定96孔板的OD值，另一組用實(shí)驗(yàn)方法1.3.3測(cè)定金黃色葡萄球菌生物被膜活菌量，建立OD值和活菌量之間的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌生物被膜制備單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 細(xì)菌接種濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響

在培養(yǎng)基pH值為7，培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間48h條件下，不同細(xì)菌接種濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜所測(cè)OD值的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著細(xì)菌接種濃度的增加，生物被膜OD值呈上升趨勢(shì)，當(dāng)細(xì)菌接種濃度由105CFU/mL增長(zhǎng)到107CFU/mL時(shí)，生物被膜OD值顯著增加；當(dāng)初始菌懸液濃度由107CFU/mL增長(zhǎng)到109CFU/mL時(shí)，生物被膜OD值緩慢增加；繼續(xù)增加到1010CFU/mL對(duì)生物被膜OD值影響不大。當(dāng)細(xì)菌接種濃度為109CFU/mL時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)得的OD值為2.586。說(shuō)明初始菌懸液濃度增長(zhǎng)有利于生物被膜的形成，但增長(zhǎng)到一定程度后對(duì)生物被膜的生長(zhǎng)影響不大。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及方便調(diào)整菌懸液濃度的原則，確定菌懸液濃度為109CFU/mL。

2.1.2 培養(yǎng)基pH對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響

在細(xì)菌接種濃度109CFU/mL，培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間48h條件下，不同培養(yǎng)基pH值對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜所測(cè)OD值的影響如圖2所示。由圖2可知，培養(yǎng)基pH值為7，生物被膜的OD值最大，與其他培養(yǎng)基pH下形成的生物被膜的量有極顯著差異（P＜0.01）。說(shuō)明培養(yǎng)基pH值為7左右最適宜生物被膜的生長(zhǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定優(yōu)化的培養(yǎng)基pH值為6～8。

表1 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼Table 1 Factors and levels of quadratic orthogonal rotary experiment

圖1 細(xì)菌接種濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響Fig.1 Effect of suspension concentration on OD value of S.aureus biofilm

圖2 培養(yǎng)基pH對(duì)生物被膜OD值的影響Fig.2 Effect of culture medium pH on OD value of S.aureus biofilm

2.1.3 培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響

在細(xì)菌接種濃度109CFU/mL，培養(yǎng)基pH值為7，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間48h條件下，不同培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜所測(cè)OD值的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)由1%增長(zhǎng)到5%時(shí)生物被膜OD值逐漸變大，培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)由5%增長(zhǎng)到7%時(shí)生物被膜OD值變化不大。培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí)培養(yǎng)出的生物被膜所測(cè)OD值為3.037。說(shuō)明培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)的有利于生物被膜的形成，但增長(zhǎng)到一定程度后生物被膜的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。由此確定培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%進(jìn)行三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)。

圖3 培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜OD值的影響Fig.3 Effect of medium concentration on OD value of S.aureus biofilm

2.1.4 培養(yǎng)溫度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響

在細(xì)菌接種濃度109CFU/mL，培養(yǎng)基pH 值為7，培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，培養(yǎng)時(shí)間48h條件下，不同培養(yǎng)溫度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜所測(cè)OD值的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，培養(yǎng)溫度為35～40℃之間，生物被膜所測(cè)的OD值最大，而在培養(yǎng)溫度＞40℃或＜35℃時(shí)形成的生物被膜受到抑制，且高溫條件對(duì)生物被膜生長(zhǎng)抑制更為顯著。由此說(shuō)明培養(yǎng)溫度為35～40℃最適宜生物被膜的生長(zhǎng)，溫度過(guò)低或者過(guò)高生物被膜都將被抑制。因此確定優(yōu)化的培養(yǎng)溫度為35～40℃，進(jìn)行三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)生物被膜OD值的影響Fig.4 Effect of culture temperature on OD value of S.aureus biofilm

2.1.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響

在細(xì)菌接種濃度109CFU/mL，培養(yǎng)基pH值為7，培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，培養(yǎng)溫度37℃條件下，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜所測(cè)OD值的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，培養(yǎng)時(shí)間由12h增長(zhǎng)到36h時(shí)，生物被膜OD值顯著增加。培養(yǎng)時(shí)間36～60h時(shí)，生物被膜OD值緩慢增長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)間60～84h時(shí)，生物被膜OD值與培養(yǎng)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。原因可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)大量消耗底物，當(dāng)?shù)孜锕?yīng)不足時(shí)，為適應(yīng)不利環(huán)境，孔壁的生物被膜態(tài)菌會(huì)脫落、死亡或休眠一部分。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定優(yōu)化的培養(yǎng)時(shí)間為48～72h進(jìn)行三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生物被膜OD值的影響Fig.5 Effect of culture time on OD of S.aureus biofilm

2.2 金黃色葡萄球菌生物被膜制備優(yōu)化

二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。采用Design Expert 8.0軟件，通過(guò)其對(duì)其回歸過(guò)程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，尋求最優(yōu)相應(yīng)因子水平，并建立多元回歸模型。

表2 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Design and results of quadratic orthogonal rotating test

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型顯著性檢驗(yàn)P＜0.05，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由圖4知其自變量一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)AB、AC、BC、A2、B2、C2顯著（P＜0.05）。校正決定系數(shù)R2adj（0.987 0＞0.80）和變異系數(shù)（cofficient of variation，CV）為0.54%，說(shuō)明該模型只有0.54%的變異能由該模型解釋。利用Design-Expert 8.5 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到OD值與各因素之間的回歸方程如下：

通過(guò)對(duì)各個(gè)變量求偏導(dǎo)，得出各參數(shù)的最優(yōu)值為：A=37.49，B=64.9，C=7.3，此時(shí)的理論優(yōu)化值為3.113 8。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，OD值為3.108，與測(cè)定值相差0.186%，說(shuō)明結(jié)果真實(shí)可靠。

2.3 響應(yīng)面立體圖及分析

由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為一定值時(shí)，生物被膜OD值隨著培養(yǎng)溫度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)溫度在較低水平時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生物被膜OD值影響不大。當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間從48～72h，生物被膜OD值先顯著增加，當(dāng)達(dá)到最佳水平后，培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)增大時(shí)，生物被膜OD值漸漸下降。

圖6 培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)OD值影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.6 Response surface plot and contour line of interaction between culture temperature and culture time on OD value

由圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH為一定值時(shí)，生物被膜OD值隨著培養(yǎng)溫度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)溫度在較低水平時(shí)，培養(yǎng)基pH對(duì)生物被膜OD值影響不大。當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，培養(yǎng)基pH6.0～8.0，生物被膜OD值先呈顯著增加趨勢(shì)，當(dāng)達(dá)到最佳水平后，培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)增大時(shí)，生物被膜OD值逐漸下降。

圖7 培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)基pH對(duì)OD值影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.7 Response surface plot and contour line of interaction between culture temperature and medium pH on OD value

由圖8可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH在較低水平時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生物被膜OD值影響不大。當(dāng)培養(yǎng)基pH在7.0～7.5左右時(shí)，生物被膜OD值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈先顯著上升，到達(dá)最佳水平后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在66h左右時(shí)，生物被膜OD值隨著培養(yǎng)基pH的增加呈先顯著上升，到達(dá)最佳水平后緩慢下降的趨勢(shì)。

圖8 培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)基pH對(duì)OD值影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.8 Response surface plot and contour line of interaction between culture time and medium pH on OD value

2.4 金黃色葡萄球菌生物被膜吸光度與活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

如圖9所示，實(shí)驗(yàn)測(cè)定的金黃色葡萄球菌生物被膜OD值（X）與活菌數(shù)（Y）間關(guān)系為Y=2.115X+0.0474，R2=0.996 2。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌生物被膜OD值（X）與活菌數(shù)（Y）呈線性相關(guān)。

圖9 生物被膜OD值與活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of biofilm OD value and living bacterium number

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)菌接種濃度與金黃色葡萄球菌生物被膜的生長(zhǎng)有關(guān)，細(xì)菌接種濃度大于107CFU/mL時(shí)更容易生成生物被膜。根據(jù)陳強(qiáng)等[14]研究，細(xì)菌粘附量與生物被膜的生長(zhǎng)呈正比，初細(xì)菌接種濃度越高越有利于細(xì)菌的粘附；培養(yǎng)基的濃度越高越有利于生物被膜的形成，但培養(yǎng)基濃度達(dá)到一定濃度后生物被膜生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定；培養(yǎng)基pH值在7.3左右時(shí)生物被膜最有利于生物被膜的生長(zhǎng)，而pH值為7.4也是浮游態(tài)金黃色葡萄球菌的最適生長(zhǎng)環(huán)境，這個(gè)結(jié)論與段韻涵等[15]的研究相符合；金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)36h時(shí)既能形成較穩(wěn)定的生物被膜，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加生物被膜生長(zhǎng)量先升后降，可能是因?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間的增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，在不利環(huán)境中，生物被膜態(tài)菌會(huì)脫落、死亡一部分；培養(yǎng)溫度在37.5℃時(shí)，最利于生物被膜生長(zhǎng)。根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出當(dāng)溫度為37.49℃，培養(yǎng)時(shí)間為64.9h，培養(yǎng)基pH值為7.3時(shí)生物被膜生長(zhǎng)最佳，此時(shí)的理論優(yōu)化值為3.113 8。該模型變異系數(shù)（CV）為0.54%，進(jìn)一步說(shuō)明模型擬合度較好，可用來(lái)對(duì)生物被膜生長(zhǎng)情況進(jìn)行初步分析和預(yù)測(cè)。通過(guò)建立金黃色葡萄球菌生物被膜吸光度值與活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，改良微孔板法可以定量分析生物被膜的活菌數(shù)，實(shí)驗(yàn)擬合度較高。

[1]孫紀(jì)錄，韓小雪，韓北忠.金黃色葡萄球菌生物被膜的控制方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2011，30（6）：1-3.

[2]丁 嵐，侯曉彥，王小紅，等.張永霞乳糖誘導(dǎo)葡萄球菌腸毒素A 基因在大腸桿菌中的表達(dá)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（2）：255-260.

[3]SHARMA M,ANAND S K.Characterization of constitutive microflora of biofilms in dairy processing lines[J].Food Microbiol,2002,19(9):627-636.

[4]COSTERTON J W.Introduction to biofilm[J].Int J Antimicrob Agents,1999,11(3-4):217-221.

[5]SIBONI N,LIDOR M,KRAMARSKY-WINTER E,et al.Conditioning film and initial biofilm formation on ceramics tiles in the marine environment[J].FEMS Microbiol Lett,2007,274(1):24-29.

[6]DONLAN R M,COSTERTON J W.Biofilms:survival mechanisms of clinically relevant microorganisms[J].Clin Microbiol Rev,2002,15(2):167-193.

[7]LELIéVRE C,LEGEGENTILHOMME P,GAUCHER C,et al.Cleaning in place:effect of local wall shear stress variation on bacterial removal from stainless steel equipment[J].Chem Eng Sci,2002,57 (8):1287-1297.

[8]李燕杰，杜 冰，董吉林，等.食品中細(xì)菌生物被膜及其形成機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（4）：435-438.

[9]WIRTAAEN G,SALO S.Disinfection in food processing efficacy testing of disinfectants[J].Rev Environ Sci Biotechnol,2003,2(2-4):293-306.

[10]錢群英.嗜水氣單胞菌生物被膜形成和估算方法[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2006.

[11]O'TOOLE G A,KOLTER R.Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development[J].Mol Microbiol,1998,30(2):295-304.

[12]HEILMANN C,GERKE C,PERDREAU-REMINGTON F,et al.Characterization of Tn917 insertion mutants of Staphylococcus epidermidis affected in biofilm formation[J].Infect Immun,1996,64(1):277-282.

[13]STEPANOVIC S,VUKOVIC D,DAKIC I,et al.A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation[J].J Microbiol Meth,2000,40(2):175-179.

[14]陳 強(qiáng)，鄢慶枇，鄒文政，等.環(huán)境因子對(duì)溶藻弧菌粘附大黃魚(yú)表皮粘液影響的研究[J].海洋與湖沼，2007，38（4）：361-366.

[15]段韻涵，韓北忠，楊葆華，等.培養(yǎng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響[J].中國(guó)釀造，2008，27（3）：17-20.