白腐乳及其生產過程中蠟樣芽孢桿菌的污染及防治

周婷婷，易敏英，相大鵬，李 理*

（1.華南理工大學 輕工與食品學院，廣東 廣州 510640；2.廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623）

豆腐乳被譽為是中國的大豆奶酪，是豆腐經毛霉發酵、鹽腌后熟而制成的一種食品，可佐餐，亦可調味。中國是腐乳的發源地，各地腐乳具有不同的風味特色[1]，受到消費者的歡迎。由于腐乳是敞開式發酵，且大多為傳統的手工操作，因此很容易受到各種環境微生物的污染[2-3]，從而影響產品的品質，甚至對消費者的安全帶來隱患。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種條件致病菌，通常當其在食物中的含量超過105CFU/g（mL）時就有可能帶來中毒癥狀。患者感染了蠟樣芽孢桿菌，通常會產生嘔吐、腹瀉等癥狀，同時伴有頭暈、惡心、發熱，腸毒素和嘔吐毒素是引起上述癥狀的主要原因。該菌抗逆性強在環境中分布極為廣泛，是腐乳生產中常見的污染菌[4-5]。該實驗研究了白腐乳中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況，并進一步分析了某品牌腐乳生產環節中的污染狀況，為腐乳生產的安全性改善提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白腐乳樣品：市售；生產環節的半成品（包括生豆漿、熟豆漿、黃漿水、酸漿水、豆腐、種水、毛坯、鹽坯、鹽水及后熟等樣品）：某品牌生產廠家；營養肉湯、營養瓊脂、平板計數瓊脂、甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂培養基（mannitol yolk polymyxin agar base，MYP）（一次性成品培養基）、血平板培養基（一次性成品培養基）：廣東環凱微生物科技有限公司；API 50 CHB/E 培養基：法國生物梅里埃公司；AgNO3：天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

JJ500電子天平：浙江余姚紀銘稱重校驗設備有限公司；YXQ-SG46-280S手提式高溫滅菌鍋：合肥華泰醫療設備有限公司；SW-CJ-ID單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱：上海申賢恒溫設備廠；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；HSG-IB-2電熱恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；DensiCHEKPlus數字顯示電子比濁儀：法國生物梅里埃公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌落總數的檢測方法[6]

在無菌操作室內對樣品進行處理，用研缽將樣品充分的研磨，稱取25g（量取25mL）處理好的待測樣品于225mL、8.5%的無菌生理鹽水中進行稀釋。選擇3個合適稀釋度的菌懸液，吸入1mL菌懸液于無菌培養皿中，每個菌懸液測兩個平行，然后向每個無菌培養皿中傾注15～20mL平板計數瓊脂培養基（約46℃）并混勻。待瓊脂凝固后翻轉平板，置于37℃培養箱中培養（48±2）h后計數。每克或每毫升樣品中所含的菌落總數的計算公式如下：

式中：N為樣品菌落總數，CFU/g；∑C為適宜計數范圍內平板菌落數之和；n1和n2分別為第一個和第二個適宜稀釋度平板數；d為稀釋因子。

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌總數的檢測方法[7]

樣品處理及稀釋同1.3.1，選取3個合適的稀釋度，分別吸取0.1mL菌懸液于MYP選擇性培養基中，每個稀釋度測2個平行，用L型涂布棒均勻涂布，37℃培養（12～20）h后計數。根據國家標準，蠟樣芽孢桿菌在MYP平板上的典型菌落為粉紅色（表示不發酵甘露醇），周圍有粉紅色的暈（表示產生卵磷脂酶）。挑取5個可疑的蠟樣芽孢桿菌菌落進行生化鑒定分析。若經生化鑒定檢測出其中A個菌落為蠟樣芽孢桿菌，此稀釋度共有B個可疑的蠟樣芽孢桿菌菌落，則每克或每毫升樣品所含蠟樣芽孢桿菌數計算公式如下：

式中：X為樣品蠟樣芽孢桿菌數，CFU/g；A為挑取的5個疑似蠟樣芽孢桿菌菌落中，經生化鑒定分析確信為蠟樣芽孢桿菌的菌落數；B為該稀釋度下可疑蠟樣芽孢桿菌的總數；10為吸取0.1mL菌懸液進行涂布的稀釋倍數。

1.3.3 蠟樣芽孢桿菌的生化鑒定[8]

試驗采用API 50 CHB/E試劑盒對蠟樣芽孢桿菌進行生化鑒定。該試劑盒是一種快速檢測培養基，它含有50種發酵作用的糖API 50CH試驗條。首先將需要鑒定的蠟樣芽孢桿菌可疑菌落分離純化，并在血平板培養基上面富集培養，刮下菌胎于特殊培養液制成濁度≥2.0麥氏單位的菌懸液，接種于試劑條的每一個管，在30℃條件下培養24h后閱讀試劑條。由于糖發酵產酸，使試劑條變色，然后以陰性（－）、陽性（＋）、可疑（?）記錄每一個試驗結果，將結果記錄在結果判讀單上。繼續培養24h，再次記錄每個生化反應的結果。將兩次判讀的結果都輸入ApiLab軟件（生物梅里埃，法國）進行鑒定分型。

1.3.4 氯化鈉含量的測定方法[9]

取適量待測樣品于研缽中研磨，轉8g研磨好的樣品于小燒杯中，加少量60℃的溫水溶解攪拌，并于電爐上加熱煮沸，一邊攪拌一邊冷卻至室溫，然后轉入100mL容量瓶中定容，混勻，測定鹽含量前可用濾紙進行過濾。

配制0.100mol/L的硝酸銀標準液，以絡酸鉀作為指示劑。吸取2.0mL樣品液于錐形瓶中，加入50mL蒸餾水及2滴絡酸鉀指示劑，搖勻，用硝酸銀標準液滴定至剛剛出現磚紅色，同時做空白對照，食鹽含量的計算公式如下：

式中：X為食鹽含量，g/100g；V1為測試樣品時消耗硝酸銀標準滴定液的體積，mL；V2為空白對照所消耗的硝酸銀標準滴定液的體積，mL；C為硝酸銀標準滴定液的濃度，mol/L；m為稱取樣品的質量，g；0.058 5為1.00mL硝酸銀標準液的濃度相當于氯化鈉的質量，g。

1.3.5 水分含量的測定方法[1]

取一塊腐乳，放在漏斗上10min左右濾去鹵湯，在研缽中充分研磨，稱取研磨好的樣品5g左右，在烘干至質量恒定的稱量瓶中平鋪，加蓋，精密稱量。置于105℃烘箱內，干燥4h，加蓋置于干燥器中冷卻0.5h后稱量，然后再干燥1h，冷卻0.5h后再稱量，直到兩次稱量差＜2mg即為恒質量，水分含量的計算公式如下：

式中：m1為稱量瓶和樣品的質量，g；m2為稱量瓶和樣品干燥后的質量，g；m3為稱量瓶的質量，g。

2 結果與分析

2.1 腐乳細菌總數及蠟樣芽孢桿菌數分析

白腐乳樣品菌落總數及蠟樣芽孢桿菌的檢測結果見表1。

表1 白腐乳中細菌總數、蠟樣芽孢桿菌數及鹽含量、水分含量的分析Table 1 Analysis of total bacterial count, Bacillus cereus count,salt content and water content in sufu

由表1可知，所檢測的白腐乳樣品菌落總數在102～106CFU/g。菌落總數較高主要是腐乳的生產至今仍然遵循傳統手工生產工藝，生產模式較為粗放，生產車間密封性差，操作人員衛生管理不嚴格等原因導致的[10]。在抽檢的10個白腐乳樣品中，有7個樣品檢出了蠟樣芽孢桿菌，檢出率為70%，其中有2個樣品的蠟樣芽孢桿菌數達到106CFU/g。我國并沒有現行的對腐乳中蠟樣芽孢桿菌含量限制的標準，所以，通常采用腐乳出口其他國家時，其他國家地區對蠟樣芽孢桿菌的限量標準來規范。例如香港，就按照即食食品微生物含量指引規定，當蠟樣芽孢桿菌≥105CFU/g為不可接受[11]。以出口香港蠟樣芽孢桿菌限量為標準，此次對腐乳的檢測結果顯示蠟樣芽孢桿菌超標率為30%。

由表1還可以得出，腐乳中的食鹽含量基本在6～11g/100g，腐乳中的蠟樣芽孢桿菌數并未隨著食鹽含量的變化產生明顯的規律性，這說明食鹽含量對腐乳中蠟樣芽孢桿菌的抑制還受其他因素的影響。水分含量也在一定程度上影響白腐乳中蠟樣芽孢桿菌的生長，水分含量低的樣品蠟樣芽孢桿菌數也較低，其中一些以油為湯汁的腐乳樣品中蠟樣芽孢含量較低，甚至未檢出，說明降低水分含量及油脂可以有效控制腐乳樣品中蠟樣芽孢含量。

2.2 白腐乳中間產品的細菌總數及蠟樣芽孢桿菌數分析

2.2.1 白腐乳前期發酵中間產品的細菌總數及蠟樣芽孢桿菌數分析

為了探明腐乳中蠟樣芽孢桿菌的污染途徑，本研究從某品牌生產廠家現場采集不同階段的中間產品共9個樣品，并重復3次，檢測其細菌總數及蠟樣芽孢桿菌數，以期在源頭上控制其數量，其中間產品的細菌總數分析結果見表2，蠟樣芽孢桿菌數分析結果見表3。

表2 腐乳中間產品的細菌總數分析Table 2 Total bacterial count in the semi-finished products of sufu

由表2可知，在腐乳的整個生產過程中，菌落總數一直處于較高的水平，3批樣品的菌落總數平行度很高。在生豆漿中檢出的菌落總數就已達到108CFU/mL，煮漿后菌落總數降到106CFU/mL，說明加熱能夠殺死部分不耐熱的細菌；不過，在豆腐的點鹵過程中，酸漿水又引入了部分雜菌，使得豆腐坯中細菌數又有所升高，達到105CFU/g，說明酸漿水是引入細菌的重要環節。通過接種、培菌，毛坯中的細菌數進一步增加，達到109CFU/g；經過后續的搓毛和鹽腌步驟，細菌數僅有小幅度下降；最后，浸泡豆腐所用到的鹽水中也有很高的細菌數，這主要是因為，浸泡鹽坯所使用的鹽水為多次重復利用，即將上一批浸泡過腐乳的鹽水回收重新灌裝到下一批鹽坯，所以如果上一批樣品污染了雜菌則會將細菌帶入后一批的腐乳產品中[12]。

表3 腐乳中間產品的蠟樣芽孢桿菌數分析Table 3 Bacillus cereus count in semi-finished products of sufu

由表3可知，3批樣品中蠟樣芽孢桿菌數的平行度較高。在3批生豆漿中都未檢測出蠟樣芽孢桿菌，但在后兩批樣品的熟豆漿中就已檢測出蠟樣芽孢桿菌，不過含量并不高，這說明蠟樣芽孢桿菌可能來自于設備的管道污染。表3結果表明，蠟樣芽孢桿菌污染腐乳的主要中間產品為酸漿水、種水和鹽水。通過對生產現場觀察發現，黃漿水為敞開式自然發酵，因此易被環境污染。此外，由于使用傳統工藝及鹽水的循環利用，使得種水和鹽水中蠟樣芽孢桿菌處于較高的水平。當使用這樣的酸漿水來凝乳時，所獲得的豆腐乳也就含有蠟樣芽孢桿菌，再通過接種和培菌，毛坯中的蠟樣芽孢桿菌可以增殖定到一個很高的水平。由此可見，要想控制最終產品中的蠟樣芽孢桿菌數量，必須從酸漿水、種水和鹽水幾個環節著手。

2.2.2 腐乳后期發酵中產品的細菌總數及蠟樣芽孢桿菌數分析

表4 腐乳后發酵階段菌落總數和蠟樣芽孢數檢測結果Table 4 Detection results of total bacterial count and Bacillus cereus in the secondary fermentation

由表4可知，經過45d的后期發酵，腐乳中的菌落總數以及蠟樣芽孢桿菌的數量均呈下降趨勢。這是因為腐乳鹽坯中鹽含量很高，在浸入鹵湯后一段時間達到瓶內鹽含量平衡，較高的鹽含量能夠抑制細菌的生長。不過值得注意的是，細菌總數還是蠟樣芽孢桿菌數的下降空間都是有限的，僅僅是1～2個數量級的差異。經過后期發酵，起始蠟樣芽孢總數為105CFU/g的產品在出廠前降至103CFU/g，在安全限量以下，所以在前期生產結束后鹽坯中蠟樣芽孢桿菌應盡可能控制在≤105CFU/g。

2.2.3 腐乳生產中蠟樣芽孢桿菌的控制措施

由上述檢測結果可以得出，腐乳生產過程中蠟樣芽孢桿菌的污染環節主要是酸漿水的發酵、豆腐的壓制、種水的噴灑以及鹽水浸泡過程。所以，有必要在前期生產過程中將蠟樣芽孢桿菌降低到最低范圍以保證后期發酵時蠟樣芽孢桿菌處于安全水平，針對這幾個關鍵的污染環節，提出以下幾點針對性的控制措施。

首先，加強生產現場的監測，酸漿水、種水和鹽水的蠟樣芽孢桿菌水平要重點監控，一旦發現升高的跡象即迅速采取措施控制。由于生產中將黃漿水敞開放置隔夜，第二天發酵成酸漿水，酸漿水通過貼近地面的半封閉式管道流入下一生產步驟，用于點豆腐。但由于黃漿水營養豐富，易于變質，敞開放置隔夜后可能會有大量的有害微生物滋長；發酵形成酸漿水后，酸漿水貼近地面流動，很容易將土壤和空氣中的蠟樣芽孢桿菌帶入產品引起污染。所以應該采用密封容器盛放黃漿水，酸漿水應在封閉的管道內流動以避免細菌落入，除此之外，由于黃漿水要放置隔夜，還要對黃漿水進行滅菌，但因為黃漿水中還含有凝固豆腐所需的乳酸菌和酵母菌，不能采取加熱煮沸的方式來殺菌，可選取一些選擇性強的天然抑菌劑，針對性地減少或殺滅酸漿水中的蠟樣芽孢桿菌。種水和鹽水現配先用，爭取將蠟樣芽孢桿菌抑制至最低水平。

其次，選擇有效的消毒方法。目前，在所有的消毒滅菌的方法中，應用得最廣泛的是熱力滅菌，但由于蠟樣芽孢桿菌含有內生孢子，耐熱性強，用傳統的加熱煮沸方式不能達到良好的效果。如果使用具有光滑表面的設備，則應用洗滌劑清潔、流水沖洗可能更有效。當然，最有效的辦法是篩選到針對蠟樣芽孢桿菌的殺菌劑，如有報道表明過氧乙酸和二氧化氯對蠟樣芽孢桿菌有很好的殺滅效果[13]。此外，一些天然的香辛料提取物如大蒜精油也具有殺滅、抑制蠟樣芽孢桿菌的作用[14]。

第三，加強菌種管理。雖然采用傳統的自然發酵可以制備出風味獨特穩定的腐乳產品，但仍需要在風味和安全性方面取得平衡，對菌種進行分離、純化及妥善保藏都是有必要的[15]。

3 結論

檢測白腐乳及其生產的各個環節中樣品的菌落總數和蠟樣芽孢桿菌數。結果表明，白腐乳中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為70%，其中30%的樣品超出港標的要求。分析了腐乳中蠟樣芽孢桿菌的主要污染來源和污染途徑。在腐乳的生產過程中，蠟樣芽孢桿菌主要通過酸漿水、種水、鹽水污染產品，需在生產中加以控制。通過檢測蠟樣芽孢桿菌在腐乳后發酵階段的變化情況，發現成品腐乳的菌落總數和蠟樣芽孢桿菌數有一定的下降，后發酵開始之前蠟樣芽孢桿菌數為105CFU/g的產品在后發酵結束降至103CFU/g，說明如果將前期產品中的蠟樣芽孢桿菌控制在一定范圍內，經過后發酵過程，腐乳中的蠟樣芽孢桿菌即可達到出口香港要求。根據對蠟樣芽孢桿菌在腐乳生產過程中的污染情況調查，建議從加強現場監測、加強菌種管理及選擇有效消毒方法等方面降低產品中的蠟樣芽孢桿菌數。

[1]王瑞芝.中國腐乳釀造[M].北京：中國輕工業出版社，2009.

[2]HAN B Z,ROMBUSTS F M,NOUT M J.A Chinese fermented soybean food[J].Int J Food Microbiol,2001,65(1-2):1-10.

[3]ROY A,MOKTAN B,SARKAR P K.Microbiological quality of legume-based traditional fermented foods marketed in West Bengal,India[J].Food Control,2007,18(11):1405-1411.

[4]HAN B Z,CAO C F,ROMBUSTS F M,et al.Microbial changes during the production of Sufu-a Chinese fermented soybean food[J].Food Control,2004,15(4):265-270.

[5]張金蘭，魯 緋，張偉偉.腐乳中蠟樣芽孢桿菌污染情況的調查分析[J].中國釀造，2010，29（10）：15-18.

[6]中華人民共和國衛生部.GB 4789.2—2010 食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

[7]中華人民共和國衛生部.GB 4789.14—2003 食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2003.

[8]李 琳，李槿年，余為一.細菌分類鑒定方法的研究概況[J].安徽農業科學，2004，32（3）：549-551.

[9]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫局.GB/T 12457—2008 食品中氯化鈉的測定[S].北京：中國標準出版社，2008.

[10]徐海蒂，程永強，許永偉.發酵菌種對低鹽白腐乳感官品質的影響[J].食品與發酵工業，2007，33（10）：17-22.

[11]即食食品微生物指引（香港）[S].香港：食物環境衛生署，2001.

[12]高秀芝，王小芬，李獻梅.傳統發酵豆醬與商品豆醬養分及微生物多樣性比較[J].食品科學，2009，30（3）：222-226.

[13]莫金觀，鄧金花，黃 靜.不同消毒劑對蠟樣芽孢桿菌的殺滅效果比較[J].中國消毒學雜志，2008，25（6）：672-673.

[14]穆可云，李 理.蠟樣芽胞桿菌生長特性及大蒜精油對其抑菌活性的研究[J].中國釀造，2012，31（12）：131-134.

[15]Villanueva L,Ibis JZD,Dayao AS.Potential of Bacillus subtilis against powder mildew of garden pea[C].Recent advances in biofertilizers and biofungicides (PGPR) for sustainable agriculture Proceedings of 3rd Asian Conference on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR)and other Microbials,Manila,Philippines,2013,38-49.