液相色譜-串聯質譜法測定葡萄酒中赭曲霉毒素A

侯建波，謝 文，李 杰，沈煒鋒，何建敏

（1.浙江出入境檢驗檢疫局技術中心，浙江 杭州 310016；2.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 杭州 310016；3.浙江立德產品技術有限公司，浙江 杭州 310016）

赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是由生長在糧食、花生、蔬菜、水果等農作物上的曲霉屬和青霉屬產生的一種有毒代謝產物。由于其具有很高的化學穩定性和熱穩定性且對多種動物具有潛在的腎毒性、神經毒性和免疫毒性等特性，并與巴爾干地方性腎病（Balkan endemic nephropathy，BEN）有著密切的關系，因此，國際癌癥研究機構（international agency for research on cancer，IARC）將其定義為II 2B類致癌物[1]。

由于從葡萄酒中攝取到的OTA占到總攝取量的13%，因此OTA在葡萄酒中的污染情況日益受到人們的關注[2]。歐盟（European Union，EU）和國際葡萄與葡萄酒局（international organization of vine and wine，OIV）等國際組織規定葡萄酒中OTA的最大限量為2μg/L[3]，意大利和保加利亞規定啤酒中OTA含量不得超過0.2μg/L，保加利亞還規定葡萄汁中OTA含量不得超過3μg/L[4]。我國雖然尚未對葡萄酒中赭曲霉毒素A的殘留量進行明確規定，但已明確要求谷物、豆類及其制品中OTA的最大限量為5.0μg/kg[5]，飼料中OTA允許量≤100μg/kg[6]。為降低葡萄酒中赭曲霉毒素A的殘留，國際食品法典委員會（codex alimentarius commission，CAC）已經制定預防和降低葡萄酒中赭曲霉毒素A污染的操作規范[7]。

目前對于葡萄酒中赭曲霉毒素A的測定主要以高效液相色譜法[8-10]、酶聯免疫法[11-12]和液相色譜-質譜/質譜法為主[13-15]。在前處理凈化方式上，美國分析化學家協會（association of official analytical chemists，AOAC）采用免疫親和柱（immunoaffinity chromatography，IAC）進行凈化[8]，該法被OIV等國際組織所采用，但由于免疫親和柱成本過高，因此研究人員陸續研發采用HLB、C18等固相萃取柱的凈化方式[15-17]。赭曲霉毒素B（ochratoxin B，OTB）和赭曲霉毒素A在化學結構上僅相差一個氯原子，理化性質接近，且已有研究表明赭曲霉毒素B的產生幾率和毒性均較低[18]，因此本研究以赭曲霉毒素B為內標物，采用液相色譜-串聯質譜法對葡萄酒中OTA的殘留量進行測定。方法操作簡便，適用性強，測定低限滿足目前國內外對其限量的要求。可為提高葡萄酒質量安全，對葡萄酒中赭曲霉毒素A含量的檢測提供有效的技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C18固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）（500mg，3mL）：德國CNW科技公司；OasisHLBSPE柱（500mg，6mL）：美國Waters公司；MAX SPE柱（150mg，6mL）：美國Waters公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：美國Tedia公司；乙酸銨（分析純）：中國國藥集團；赭曲霉毒素A（純度＞98%）：美國Enzo Life Sciences公司；赭曲霉毒素B（質量濃度10.1μg/mL）：英國LGC標準品公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260-6490型液相色譜-串聯質譜儀：美國安捷倫公司；HERAEUS Multifuge X1R型臺式離心機：美國Thermo公司；Milli-Q Gradient型超純水凈化系統：美國Millipore公司；VISIPREPTM DL型固相萃取裝置：美國SUPELCO公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理方法

準確移取5mL葡萄酒，加入赭曲霉毒素B內標物20ng，用5%的氨水調節pH=7.0±0.3，8 500r/min離心5min，上清液轉移至C18固相萃取凈化柱（3mL甲醇和3mL水進行活化），加入5mL水進行淋洗，減壓抽干，加入5mL甲醇進行洗脫，洗脫液氮吹至近干，用甲醇/0.15%甲酸水溶液=7∶3（V/V）定容至1.0mL，過0.22μm濾膜后待測定。

1.3.2 儀器測試方法

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）。流動相：甲醇/0.15%甲酸水溶（含5mmol/L乙酸銨）=7∶3（V/V），等度洗脫；流速：0.6mL/min；進樣量：20μL；柱溫：40℃。離子源參數：干燥氣溫度250℃，干燥氣流速16L/min，霧化氣壓力0.005 6Pa，鞘氣溫度：350℃，鞘氣流速10L/min，毛細管電壓3 500V。

2 結果與分析

2.1 凈化條件的選擇

實驗發現葡萄酒自身pH值3.5～4.5，分別考察不同pH值[葡萄酒自身pH值和pH=5.0±0.3，7.0±0.3（僅MAX SPE柱）和9.0±0.3（僅MAX SPE柱）]下OTA在C18、HLB和MAX 3種類型SPE柱的色譜行為。結果表明，pH值對OTA的凈化效果影響不大，MAX SPE柱凈化譜圖背景效果最好，其凈化需要的洗脫液體積最大，且回收率較C18和HLB SPE柱約低10%。綜合考慮凈化操作的簡易程度和實驗成本等因素，最終選擇C18SPE柱在pH=7.0條件下進行凈化。

2.2 色譜條件的選擇

以Agilent Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）和Agilent Eclipse XDB-C8（150mm×4.6mm，5μm）色譜柱為基礎，對色譜分離流動相[乙腈/0.15%甲酸水溶液，甲醇/0.15%甲酸水溶液，乙腈/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸銨）和甲醇/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸銨）]和定容溶液[乙腈，甲醇，乙腈/0.15%甲酸水溶液，甲醇/0.15%甲酸水溶液，乙腈/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸銨）和甲醇/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸銨）]展開正交試驗。結果表明，酸性環境的流動相可明顯改善譜峰形狀，乙酸銨可明顯提高譜峰強度（甲醇為流動相），綜合對比譜峰的峰形、響應強度以及分離效果，最終選擇C18色譜柱，甲醇/0.15%甲酸水溶液=7∶3（V/V）為定容溶液，甲醇/0.15%甲酸水溶液（含5mmol/L乙酸銨）7∶3（V/V）為液相色譜分離體系。

2.3 質譜條件的選擇

采用流動注射的方式在正和負離子模式下對待測化合物的標準溶液分別進行稀釋和母離子全掃描，確定分子離子峰，再以分子離子峰為母離子對其子離子進行全掃描。結果顯示，OTA的[M-H]-的信號響應最低，其[M+H]+（質荷比404.2）和[M+Na]+（質荷比426.1）獲得的碎片離子如圖1所示。綜合考慮信號響應強度和離子穩定性，選擇[M+H]+及其子離子進行測試。按照歐盟EC/657指令的要求，選擇404.2/239.1和404.2/358.0為兩個特征子離子，其中404.2/239.1信噪比高、峰形好、干擾小作為定量離子對，OTB內標物離子對為370.2/205.2。

2.4 方法學考察

2.4.1 基質效應

液相色譜-串聯質譜法測定藥物殘留時，有時基質對離子對具有增強或抑制效應。本研究在不含待測目標化合物的空白葡萄酒中添加OTA的標準物質（添加質量濃度2.0μg/L），外表法定量，以抑制率[（葡萄酒基質中OTA離子對的響應強度-溶劑中OTA離子對的響應強度）/溶劑中OTA離子對的響應強度×100%]來考察基質效應情況。計算結果顯示基質抑制率約13%，最終實驗采用葡萄酒空白提取液作為標準溶液的稀釋溶液，可使標準溶液和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而克服樣品基質效應，結合OTB內標法消除操作過程中的系統誤差，更好地保證測定結果的準確性。

圖1 赭曲霉毒素A([M+H]+和[M+Na]+)和赭曲霉毒素B(M+H]+)的離子全掃描質譜圖Fig.1 Full scan ion spectrogram of ochratoxin A and ochratoxin B

2.4.2 方法的線性關系、定量限和方法精密度

在確定的實驗條件下展開測試，測定各化合物的譜峰面積，以質量濃度x（μg/L）為橫坐標，以OTA與OTB的峰面積比值y為縱坐標，繪制OTA標準工作曲線，OTA的溶液質量濃度分別為0、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、50ng/mL（OTB內標物溶液質量濃度20ng/mL）；OTA的相應質量濃度分別為0、2.0μg/L、4.0μg/L、8.0μg/L、10.0μg/L。OTA標準曲線的線性回歸方程：y=0.141x+0.002 63，相關系數0.998 5。在OTA含量為2.0μg/L時，信噪比約384＞10，即該方法滿足歐盟和OIV設定的OTA定量限要求，可進行準確定量OTA。

選用不含待測組分的空白葡萄酒，分別添加OTA標準溶液，添加質量濃度分別均為2.0μg/L、4.0μg/L和8.0μg/L，實驗結果如表1所示。由表1可知，赭曲霉毒素A回收率范圍97.6%～109.7%，相對標準偏差（relativestandarddeviation，RSD）3.0%～4.6%。葡萄酒中OTA標準溶液的LC-MS/MS測試選擇離子流圖如圖2所示。

表1 葡萄酒中赭曲霉毒素A的回收率及精密度Table 1 Recovery rate and precision of ochratoxin A in wine sample

圖2 不同條件下赭曲霉毒素A的選擇性離子流圖Fig.2 Selected ion chromatograms of ochratoxin A in different conditions

3 結論

本研究通過C18固相萃取凈化，采用液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），在正離子多反應監測模式下對葡萄酒中赭曲霉毒素A進行測定。以赭曲霉毒素B為內標物進行定量計算，方法定量限2.0μg/L。在0～10μg/L質量濃度范圍內線性相關系數R＞0.998。回收率范圍97.6%～109.7%，相對標準偏差RSD 3.0%～4.6%，該方法簡便快速，準確度高，精密度好。滿足歐盟和OIV等國際機構對葡萄酒中OTA的限量法規要求，可用于葡萄酒中赭曲霉毒素A的定量測定。

[1]International agency for research on cancer.Some naturally occurring substances:food items and constituents,heterocyclic aromatic amines and mycotoxins[C].IARC working group on the evaluation of carcinogenic risks to humans,Lyon,1993.

[2]Joint FAO/WHO food standards programme codex committee on food additives and contaminants.thirty-eighth session[C].The Hague,the Netherlands,24-28 April 2006.

[3]EU commission.commission regulation EC No 123/2005 of 26 January 2005 amending regulation(EC)No 466/2001 as regards ochratoxin A[J].Off J Eur Commun L,2005,25:3-5.

[4]IQBAL S Z,RABBANI T,ASI M.R,Assessment of aflatoxins,ochratoxin A and zearalenone in breakfast cereals[J].Food Chem,157(8):257-262.

[5]中華人民共和國衛生部.GB 2761—2011 食品安全國家標準食品中真菌毒素限量[S].北京：中國標準出版社，2011.

[6]中國國家標準化管理委員會.GB 13078.2—2006 飼料衛生標準飼料中赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮的允許量[S].北京：中國標準出版社，2006.

[7]CAC/RCP 63-2007.Code of practice for the prevention and reduction of ochratoxin A contamination in wine[OL].http://std.gdciq.gov.cn/gssw/JiShuFaGui/CAC/cxp_063e.pdf.

[8]VISCONTI A,PASCALE M,CENTONZE G.Determination of ochratoxin A in wine and beer by immunoaffinity column cleannup and liquid chromatographic analysis with fluorometric detection:collaborative study[J].J AOAC Int,2001,84(6):l818-l827.

[9]張曉旭，馬麗艷，楊麗麗，等.C18固相萃取柱-高效液相色譜法測定葡萄干中赭曲霉毒素A[J].分析試驗室，2012，31（7）：64-67.

[10]SYLVIE B,KAROL?NA B,RENATA M,et al.Determination of ochratoxin A in brewing materials and beer by ultra performance liquid chromatography with fluorescence detection[J].Food Chem,2011,126(1):321-325.

[11]BEATRIZ P S,MONICA C,JEAN-LOUIS M,et al.Novel highly-performing immunosensor-based strategy for ochratoxin A detection in wine samples[J].Biosens Bioelectron,2008,23(7):995-1002.

[12]熊勇華，陳雪嵐，許 楊.檢測赭曲霉毒素A（OTA）的酶聯免疫吸附法（ELISA）體系的建立[J].食品科學，2006，27（5）：30-35.

[13]康 健，鐘其頂，熊正河，等.葡萄酒中赭曲霉素A 測定方法的研究[J].食品與發酵工業，2009，35（3）：153-157.

[14]REINSCH M,T?PFER A,LEHMANN A,et al.Determination of ochratoxin A in beer by LC-MS/MS ion trap detection[J].Food Chem,2007,100(1):312-317.

[15]閻龍寶，王 浩.液相色譜-質譜聯用技術測定葡萄酒中的赭曲霉毒素A 殘留[J].食品研究與開發，2010，31（6）：136-138.

[16]宗 腩，李景明，張柏林.檢測葡萄酒中赭曲霉毒素A 的SPE-HPLC方法優化[J].中國釀造，2011，30（4）：32-35.

[17]馬 莉，康維鈞，陳 慶，等.固相萃取-高效液相色譜法檢測葡萄酒中赭曲霉毒素A[J].分析試驗室，2007，26（4）：81-84.

[18]MALLY A,KEIM-HEUSLER H,AMBERG A,et al.Biotransformation and nephrotoxicityofochratoxin Bin rats[J].Toxicol Appl Pharm,2005,206(1):43-53.