富含纖溶酶低鹽豆醬加工工藝及品質(zhì)分析

李大鵬，高玉榮，馬 晶

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

目前心腦血管疾病正日益嚴(yán)重的危害著人們的健康，已成為目前全世界人類死亡的主要原因之一[1]。隨著我國人口老齡化形勢日益嚴(yán)峻，心腦血管疾病對我國社會的危害還將不斷增加[2-3]。納豆是日本的一種傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，研究發(fā)現(xiàn)，納豆中含有的納豆激酶具有很強(qiáng)的溶栓作用，可以防治心腦血管疾病[4]。作為防治心腦血管疾病的主要藥物—尿激酶和蚓激酶，其半衰期較短，而且對人體有很大的副作用，會導(dǎo)致人體的出血[5-6]。微生物產(chǎn)生的溶栓酶不僅直接起到溶栓的作用，而且能激活人體的纖維蛋白溶酶原和尿激酶原，從而表現(xiàn)出很強(qiáng)的間接溶栓作用。因此微生物產(chǎn)生的溶栓酶在人體內(nèi)的作用時間較長且安全性高[7]。

我國目前對溶栓功能性大豆發(fā)酵食品的研究主要是模仿國外的納豆產(chǎn)品，但這些產(chǎn)品由于市場、口味等原因目前很難進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化推廣[8-10]。豆醬是我國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，但我國豆醬在生產(chǎn)中所用的菌種及產(chǎn)品品種單一，生產(chǎn)周期較長，產(chǎn)品中功能性成分的含量較低，食鹽含量高。因此，實驗以篩選出的高產(chǎn)溶栓酶的優(yōu)良菌株為發(fā)酵菌種，研制符合中國人口味的富含溶栓酶的低鹽豆醬。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌M64：實驗室分離獲得的高產(chǎn)纖溶酶菌株，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院保藏[11]。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，pH值7.2～7.4。

營養(yǎng)肉湯斜面固體培養(yǎng)基：瓊脂2.0%，其余同營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信試驗儀器有限公司；HZQ-QX全溫振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；BCN-1360生物潔凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 低鹽豆醬加工工藝流程

1.3.2 工藝說明

（1）挑選、浸泡、蒸煮：挑選顆粒飽滿，成熟、無霉?fàn)€、無蟲蝕的新鮮黃豆。加入黃豆質(zhì)量2倍的自來水，30℃浸泡4～5h。121℃高壓蒸煮35min，冷卻至40℃以下接種。

（2）菌種活化及擴(kuò)培：將枯草芽孢桿菌M64斜面菌種1環(huán)接入營養(yǎng)肉湯斜面固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24 h。接種培養(yǎng)好的斜面菌種1環(huán)到營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h。

（3）制曲：將擴(kuò)培的菌種按照一定接種率接種至蒸煮并冷卻的黃豆中培養(yǎng)。

（4）發(fā)酵：將制曲結(jié)束后的豆曲，加鹽水，在45～55℃條件下發(fā)酵10d 左右。

1.3.3 檢測方法

感官指標(biāo)分析：按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24399—2009《黃豆醬》[12]中的方法進(jìn)行。

理化指標(biāo)分析：氨基酸態(tài)氮、水分：按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24399—2009[12]中的方法進(jìn)行；食鹽含量：按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[13]中的方法進(jìn)行；纖溶酶活性測定：采用血纖維蛋白平板法測定[14-15]；蛋白酶活性測定：按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[16]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆醬制曲工藝研究

豆豉制曲的目的是使菌種在蒸煮后的豆粒上生長并產(chǎn)酶，為了生產(chǎn)具有溶栓功能的豆醬，需要使菌在產(chǎn)生蛋白酶的同時產(chǎn)生大量的纖溶酶。因此蛋白酶和纖溶酶活力的高低是檢驗制曲品質(zhì)的指標(biāo)。實驗以蛋白酶和纖溶酶的活力為指標(biāo)，研究了接種量、制曲溫度和制曲時間對酶活力的影響，以確定最佳的制曲工藝條件。

2.1.1 接種量對纖溶酶和蛋白酶活力的影響

將蒸煮冷卻后的大豆，按照不同的接種量接種后，在36℃、相對濕度85%的條件下培養(yǎng)24 h后，纖溶酶和蛋白酶活力如圖1所示。由圖1可以看出，由于接種量影響菌體的生長量，纖溶酶和蛋白酶都是枯草芽孢桿菌M64的次級代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致接種量對纖溶酶和蛋白酶活力的影響呈現(xiàn)相同的趨勢。當(dāng)接種量為0.5%～1.5%時，隨著接種量的增加，纖溶酶和蛋白酶活力顯著增大，接種量繼續(xù)增加，酶產(chǎn)量不再增加。這主要是由于接種量過大時，菌體過量生長，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的過量消耗、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量下降，因此適宜的接種量為1.5%。

圖1 接種量對纖溶酶和蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of inoculum on fibrinolytic enzyme andprotease activity

2.1.2 制曲溫度對纖溶酶和蛋白酶活力的影響

圖2 溫度對纖溶酶和蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on fibrinolytic enzyme and protease activity

將蒸煮冷卻后的大豆，接入1%的枯草芽孢桿菌M64菌懸液，相對濕度85%，在不同的溫度條件下培養(yǎng)24h后，纖溶酶和蛋白酶活力如圖2所示。由圖2可以看出，溫度對纖溶酶和蛋白酶活力影響顯著。36℃時纖溶酶活力最大，而32℃時蛋白酶活力最大，但32℃和36℃時蛋白酶活力差異不顯著，因此，適宜的發(fā)酵溫度選擇為36℃。

2.1.3 制曲時間對纖溶酶和蛋白酶活力的影響

圖3 時間對纖溶酶和蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of time on fibrinolytic enzyme and protease activity

將蒸煮冷卻后的大豆接入1%的菌懸液，32℃、相對濕度85%培養(yǎng)不同時間后，纖溶酶和蛋白酶活力見圖3。由圖3可以看出，發(fā)酵時間對纖溶酶和蛋白酶活力影響顯著。當(dāng)發(fā)酵時間＜36h時，隨著發(fā)酵時間的延長活力逐漸增大，當(dāng)發(fā)酵時間＞36h時，纖溶酶和蛋白酶的活力不再增大。因此，適宜的發(fā)酵時間為36h。

在單因素確定的最佳制曲條件：接種量1.5%，制曲溫度36℃，制曲時間36h進(jìn)行3次平行實驗，實驗結(jié)果見表1。

表1 最佳制曲條件下的酶活性Table 1 Enzyme activity under the optimal koji-making condition

由表1可見，在最佳的制曲條件下，豆曲中的蛋白酶和纖溶酶活性分別可達(dá)3 432U/g和2 168U/g。

2.2 發(fā)酵工藝研究

發(fā)酵豆醬時，在制曲過程中產(chǎn)生的蛋白酶使物料中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)分解成氨基酸等小分子物質(zhì)。氨基酸態(tài)氮含量是豆醬主要的理化指標(biāo)，因此實驗研究加水量、發(fā)酵溫度和時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響，以確定豆醬發(fā)酵工藝條件。

2.2.1 加水量對豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

圖4 加水量對豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of water addition on amino acid nitrogen content of soybean paste

將大豆曲加入不同量的8%鹽水，45℃密閉發(fā)酵6d，氨基酸態(tài)氮的含量見圖4。由圖4可以看出，隨著加水量的增加，豆醬中氨基酸態(tài)氮含量呈上升趨勢，但當(dāng)加水量高于90%時，蛋白水解基本完全，隨著加水量的增加氨基酸態(tài)氮含量開始降低，因此最適加水量為90%。

2.2.2 食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

將大豆曲添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鹽水，45℃密閉發(fā)酵6d，氨基酸態(tài)氮的含量見圖5。由圖5可以看出，隨著食鹽含量的增加，豆醬中的氨基酸態(tài)氮含量呈下降的趨勢，當(dāng)食鹽含量＞10%時，氨基酸態(tài)氮含量顯著降低，因此選擇適宜的食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。

圖5 食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of salt concentration on amino acid nitrogen content of soybean paste

2.2.3 發(fā)酵溫度對豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

圖6 發(fā)酵溫度對豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen content of soybean paste

將大豆曲添加10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鹽水，不同溫度下密閉發(fā)酵6d，氨基酸態(tài)氮的含量見圖6。由圖6可以看出，隨著溫度的升高，氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，但當(dāng)溫度高于50℃時，氨基酸態(tài)氮含量開始下降，這說明豆醬發(fā)酵過程中，蛋白酶最適作用溫度為50℃。溫度過高，使過多氨基酸與糖反應(yīng)生成類黑素類物質(zhì)，豆醬顏色過深，營養(yǎng)物質(zhì)損失較大，因此，選擇最適發(fā)酵溫度為50℃。

2.2.4 發(fā)酵時間對豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

將大豆曲添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%鹽水，45℃密閉發(fā)酵一定時間后，氨基酸態(tài)氮的含量見圖7。由圖7可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，豆醬中的氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這是由于隨著發(fā)酵時間的延長，豆曲中的蛋白質(zhì)逐漸被蛋白酶水解釋放出來，但當(dāng)發(fā)酵時間超過7d后，此時蛋白已被完全水解，隨著時間的延長，還有一部分氨基酸會在較高的溫度條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)，降低氨基酸的含量，因此，選擇最適的發(fā)酵時間為7d。

圖7 發(fā)酵時間對豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on amino-acid nitrogen content of soybean paste

2.3 產(chǎn)品品質(zhì)分析

2.3.1 感官指標(biāo)分析

表2 豆醬感官分析結(jié)果Table 2 Organoleptic analysis of soybean paste

由表2可以看出，實驗研制的溶栓功能低鹽豆醬顏色、香氣、滋味和體態(tài)符合GB/T 24399—2009《黃豆醬》的要求。

2.3.2 理化指標(biāo)分析結(jié)果

表3 豆醬理化指標(biāo)分析結(jié)果Table 3 Physicochemical indexes of soybean paste

由表3可以看出，實驗研制的豆醬的水分含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)（≤65.0g/100g），氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到0.74g/100g，高于國家標(biāo)準(zhǔn)0.6g/100g的要求，這說明研制的豆醬在發(fā)酵過程中蛋白等大分子物質(zhì)水解完全，產(chǎn)品中的氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)容易被人體吸收利用。一般豆醬中食鹽含量＞9%，而實驗研制的豆醬含鹽量為傳統(tǒng)豆醬的50%，含鹽量低。豆醬中的纖溶酶活性達(dá)到1 070U/g。

3 結(jié)論

以蛋白酶和纖溶酶的活力為指標(biāo)，確定了富含纖溶酶活性豆豉的制曲工藝條件為接種量1.5%，制曲溫度36℃，制曲時間36h，在此條件下豆曲中的蛋白酶和纖溶酶活性為3 432U/g和2 168U/g。

以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，研究確定了豆醬最佳發(fā)酵工藝條件為加水量90%，食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間7d，在此條件下豆醬中的氨基酸態(tài)氮含量為0.76%。

研制的富含溶栓酶低鹽豆醬的感官指標(biāo)和理化指標(biāo)符合豆醬的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24399—2009《黃豆醬》的要求，食鹽含量4.72g/100g，為傳統(tǒng)豆醬的50%，纖溶酶活性的達(dá)到1 070U/g。

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