凝膠注入系統在DNA分型中的影響分析及解決方法

常海龍 公安部第一研究所

一、引言

DNA分型自20世紀80年代中期問世以來，在法醫學領域引發了革命性的變革，極大提高了執法部門根據現場搜尋罪犯的能力。DNA分型就是通過對遺傳物質DNA序列多態性及長度多態性的檢驗來進行法醫學的個體識別及親權鑒定。如今，該技術已經成為法醫物證檢驗的常規技術，為打擊違法犯罪提供了強有力的武器。

毛細管凝膠電泳是目前應用最為廣泛、技術最為成熟的主流DNA分型技術，被全世界范圍內的法醫學DNA實驗室廣泛采用。毛細管凝膠電泳向毛細管柱中充入凝膠聚合物等篩分介質，通過建立高壓直流電場驅動帶負電的DNA片段，通過篩分介質，對DNA片段按其大小進行篩分分離。

公安部第一研究所在國家十一五課題“法醫DNA專用檢測硬件平臺關鍵技術研究”的支撐下，成功研制了基于毛細管凝膠電泳的GA118-16A遺傳分析儀，其中凝膠注入系統是具有自主知識產權的關鍵核心部件。本文對凝膠注入系統工作原理及對DNA分型結果影響要素進行分析，結合在凝膠注入系統研制過程及產業化過程中遇到的常見問題，提出解決方法，期待對公安系統廣大法醫工作者有所幫助，以更好應用遺傳分析儀，為打擊違法犯罪提供更加高效的手段。

二、DNA分型原理及常用篩分介質

理想的DNA分離介質應具備以下幾種性質：（1）高親水性，（2）良好的溶解能力，（3）良好的篩分性能，（4）在堿性條件下仍具有很好的化學穩定性，（5）具有動態涂層能力以抑制電滲流及消除DNA和毛細管管壁的吸附作用。

毛細管凝膠電泳最常采用聚二甲基丙烯酰胺POP-4和POP-7聚合物用于DNA分型。聚二甲基丙烯酰胺有一定的網狀結構，是由聚丙烯酰胺和交聯共聚單體N，N’-甲叉雙丙烯酰胺在TEMED催化下聚合交聯形成的，其孔徑與鏈長度和交聯度有關。

聚二甲基丙烯酰胺的優點是吸附很小，能夠有效消除毛細管電滲現象；減小分子擴散，抗對流；具有分子篩效應，遷移時間能反映組分分子量大小；在一定溫度范圍內透明，便于觀察和實現樣品的光學檢測。但其制備復雜、產生氣泡會中斷電路，一些大分子積留會影響毛細管柱的壽命，影響聚合物的動態涂層能力和降低聚合物的黏度。

三、凝膠注入系統的組成及工作原理

要實現毛細管電泳的DNA分型，首先必須將聚二甲基丙烯酰胺等篩分介質注入內徑僅為50μm的毛細管，這需要系統提供很高的壓強，凝膠注入系統正是為實現這一功能而設計的。該系統由精密分配泵、針閥系統、下膠塊、凝膠瓶、高壓電極、毛細管等組成，系統工作介質為聚二甲基丙烯酰胺凝膠。精密分配泵提供動力源，將凝膠瓶中的凝膠吸入泵倉。凝膠瓶管路末端接上單向閥，當精密分配泵的柱塞向下運動時，單向閥關閉。若此時針閥系統打開，即下膠塊管路開通，由于毛細管的流體阻力遠大于下膠塊管路，凝膠將向下膠塊管路流動，在排除氣泡過程中經常應用此操作。當針閥系統關閉時，即下膠塊管路閉合，凝膠將向毛細管中運動，向毛細管中注入凝膠，從而實現毛細管的自動注膠功能。該系統組成參見圖2。

該系統具有氣泡排除功能。由于凝膠自身混有一定的氣泡，同時在更換凝膠的過程中，不可避免的會帶入氣泡。氣泡的存在將阻斷電泳通路或使通路不穩定。因此，當凝膠注入系統中有氣泡時，必須運行該系統的排氣泡操作，確保注入毛細管中的凝膠沒有氣泡。

為實現凝膠注入和排除氣泡操作，凝膠注入系統在下膠塊位置設計了針閥系統，這個子系統由電磁鐵、針閥銷、針閥構成，其組成見圖3。當需要閉合針閥系統時，電磁鐵關閉，電磁鐵帶動針閥銷轉動，使針閥向下運動，與下膠塊的錐形孔形成緊密配合。為了緩沖電磁鐵閉合時針閥對下膠塊的沖擊，在電磁鐵與針閥銷之間設置了一個彈簧及調節螺釘，當電磁鐵閉合時，彈簧起到一定的緩沖作用，并為針閥與下膠塊的閉合提供密封壓強。

四、DNA分型中凝膠注入系統的影響分析及解決方法

作為基于毛細管電泳的DNA檢測儀的重要組成部分，凝膠注入系統的工作狀態直接影響到DNA的檢測結果。以下是DNA檢測過程中遇到的相關問題及解決方法：

為進一步確保城區河道的行洪安全、維護河道生態健康、美化水城環境，臨沂市在沂河干支流上科學規劃建設了一系列橡膠壩和攔河閘，并通過建設開通河道間調水工程，構建城市水網，實現城區河道間生態用水的優化配置，促進水網內的水循環，實現了臨沂城區的水資源優化配置、防洪安全和水系生態安全。

（一）凝膠注入系統氣泡排除問題及解決方法

凝膠注入系統一個重要的功能就是將電泳通道中凝膠的氣泡排除。氣泡會阻斷電泳通路或改變電泳遷移率，導致嚴重的區帶擴展，降低分辨力，影響DNA檢測結果。如果氣泡進入毛細管中，直流高壓電場被切斷，電泳無法形成，不能通過篩分作用對DNA片段進行分離；如果氣泡進入集束端安裝位置或下膠塊管路中，會導致電泳通道變窄，電阻變大，電泳通道發熱，這將導致膠的黏度等性質發生變化，從而改變DNA片段在電泳過程中的遷移率，影響分離效果，嚴重時會損壞集束端和下膠塊管路。

氣泡常出現的位置有三種情況：

1．凝膠瓶管路出現氣泡

在更換凝膠瓶的過程中可能會引入新的氣泡，氣泡位于凝膠瓶管路中，此時應運行自動排氣泡程序排出氣泡。因此，在更換凝膠瓶之前，應該將待用凝膠常溫靜置2小時以上，以使凝膠中的氣泡析出；同時在更換凝膠瓶的過程中避免劇烈操作，防止凝膠瓶管路中混入氣泡。

2．毛細管集束端出現氣泡

當毛細管集束端位置紡錘體密封不嚴時，在集束端容易出現氣泡。毛細管集束端出現氣泡會導致高壓電泳通道電阻增大，氣泡位置發熱，從而影響DNA片段的遷移率，同時容易損壞集束端。此時應該擰松手輪，運行精密分配泵，使精密分配泵柱塞向下運動，使氣泡隨凝膠從集束端排除。由于凝膠具有生物毒性，操作中應佩戴手套操作，并使用滴水盤收集排除的凝膠。

3．下膠塊管路出現氣泡

當陽極杯中的緩沖液沒有達到指定體積（即達到刻度線）時，由于下膠塊管路處于開放狀態，在溫度變化的時候氣泡容易進入下膠塊管路。此處氣泡會導致下膠塊管路局部發熱，從而影響DNA片段的遷移率，同時容易損壞下膠塊管路。此時應該運行精密分配泵，使精密分配泵柱塞向下運動，使氣泡隨凝膠從下膠塊排除。

（二）凝膠注入系統凝膠無法注入問題及解決方法

凝膠注入系統的主要功能是向毛細管中注入凝膠，在遺傳分析儀的使用過程中，由于各種因素的影響，會使凝膠注入系統無法正常工作。如果儀器繼續運行，毛細管內殘留的廢膠會導致毛細管電泳過程中出現雜峰；同時會使DNA片段的遷移率變低，峰值變寬，DNA檢測過程無法正常完成。相關的問題原因及解決辦法如下：

1．如果凝膠瓶管路出現凝膠回流現象，則是單向閥出現故障

在發現凝膠注入系統出現無法注入凝膠的情況，首先應該檢查凝膠瓶管路是否出現凝膠回流現象，如果出現，說明單向閥無法實現單向密封作用。單向閥內部是由一個紅寶石球和藍寶石座組成的精密單向密封裝置，在長期不使用凝膠注入系統的時候，紅寶石球和藍寶石座由于凝膠干結附著在密封件表面，從而使單向閥失去單向密封能力。此時應取下單向閥，用超純水潤洗單向閥，清洗完畢后，再重新吸入凝膠，完成凝膠注入工作。

2．如果水洗密封艙出現凝膠，說明高壓密封圈損壞

精密分配泵的高壓實現是由藍寶石柱塞和高壓密封圈配合實現，由于長時間工作，或者由于凝膠注入系統長期不工作導致凝膠干結在柱塞表面，在柱塞運動過程中可能會損壞高壓密封圈，使藍寶石柱塞與高壓密封圈之間出現泄漏，凝膠將從此位置泄漏到水洗密封艙內。此時，應該立即停止精密分配泵的操作，更換高壓密封圈。

3．如果下膠塊管路接頭處出現凝膠，說明下膠塊管路接頭密封不嚴

下膠塊管路接頭是凝膠注入系統實現高壓的一個關鍵部件，采用錐形密封頭配合精密分配泵及下膠塊實現密封，如果固定螺母沒足夠預壓力，就會出現凝膠泄漏現象。此時應加大密封接頭固定螺母的擰緊力度，使其達到密封效果。

4．如果在毛細管集束端出現凝膠泄漏，說明毛細管集束端密封不嚴

毛細管集束端是與錐形紡錘體與手輪的配合實現密封，手輪依靠螺紋實現預緊力，紡錘體的兩端錐形面與精密分配泵和手輪密封面的配合實現高壓密封。此時，首先應擰緊手輪，加大手輪的預緊力，以提高密封面的壓力；如果加大預緊力后仍然出現凝膠泄漏現象，則是紡錘體表面有殘留雜質，應取出紡錘體及手輪，超純水潤洗后，重新安裝毛細管集束端。

5．如果從陽極杯觀察到下膠塊有凝膠流出，說明下膠塊針閥密封不嚴

下膠塊針閥密封是依靠針閥的錐形面與下膠塊配合實現高壓密封，常見的泄漏情況有兩種：（1）由于磨損導致針閥壓力不夠。針閥和下膠塊均采用塑料制成，在長期開合過程中難免有一定的磨損，此時針閥與下膠塊的配合間隙加大，容易出現凝膠泄漏現象。遇到這種情況，應該調節電磁鐵調節螺釘，增加電磁鐵與針閥銷之間彈簧的彈力，從而加大針閥與下膠塊配合的壓力，實現高壓密封。（2）下膠塊或針閥損壞。在磨損進一步加大的情況下，由于下膠塊或者針閥磨損不規則性導致密封面無法緊密配合，此時加大彈簧彈力也無法實現高壓密封，應更換下膠塊或者針閥。

6．大分子堵塞毛細管導致凝膠注入壓力過大

在毛細管長期使用過程中，一些大分子會殘留在毛細管內壁，隨著時間的推移，積累越來越多，最終導致精密分配泵的壓力不足以將適量的凝膠注入到毛細管中。這種情況需要更換新的毛細管，再進行凝膠注入。

五、結論

凝膠注入系統是遺傳分析儀的重要組成部分，凝膠注入的性能對DNA分型結果產生顯著影響，關系到設備整體工作成本、效率和使用壽命。要使凝膠注入系統盡可能長時間地保持安全、高效的工作狀態，就一定要保證凝膠注入的質量，科學合理地解決在使用中遇到的問題。

本文結合在凝膠注入系統研制和產業化過程中遇到的問題，對凝膠注入系統的工作原理進行分析，提出了法醫DNA工作人員常見問題出現的原因及解決方法。經過大量實踐驗證，上述方法能夠有效解決凝膠注入系統工作中遇到的問題，保證遺傳分析儀高效穩定地工作。

[1]John M.Butler.侯一平,李成濤譯.法醫DNA分型專論: 方法學[M]．北京:科學出版社,2013:122-123.

[2]陳義.毛細管電泳技術及應用(第二版)[M].北京:化學工業出版社,2006:59-60.

[3]方梅,胡波,田貴容,徐恒,方國楨.21世紀毛細管電泳在刑偵分析中的應用[J].分析儀器,2011(1):1-3.

[4]龐曉東,陳學亮等.DNA檢測儀器及其發展動向分析[J].警察技術,2014,1(142):8-11.