剩余污泥超聲提取液培養生物破乳菌 Alcaligenes sp. SXJ-1

黃翔峰,朱其瑋,申昌明,王 珅,陸麗君,劉 佳(同濟大學環境科學與工程學院,污染控制與資源化國家重點實驗室,上海 200092)

剩余污泥超聲提取液培養生物破乳菌 Alcaligenes sp. SXJ-1

黃翔峰,朱其瑋,申昌明,王 珅,陸麗君,劉 佳*(同濟大學環境科學與工程學院,污染控制與資源化國家重點實驗室,上海 200092)

將超聲法預處理剩余污泥得到的提取液用于培養高效生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1,以探索剩余污泥資源化利用的新途徑.使用超聲能量(ES)為443～56647kJ/kg TS的超聲條件處理剩余污泥,獲得的污泥提取液中氨氮、有機氮、總磷的濃度最高分別為171.94,142.20, 76.29mg/L,提取液中包含K、Ca、Mg、Fe等破乳菌生長必須的金屬元素.將污泥提取液(ES為885～56647kJ/kg TS)作為培養基用于合成高效破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1,產量較MMSM培養基可提高0.3%～68.3%,其中ES為56647kJ/kg TS時破乳菌產量最高,為2.03g/L.污泥提取液中的 pH緩沖能力對菌體產量有重要影響,提取液的有機氮濃度可能是破乳菌產量提高的關鍵因素.污泥提取液培養的破乳菌破乳性能穩定保持在80.0%左右,菌體細胞表面疏水性與菌體C/N較MMSM培養基培養菌體無明顯差異.說明以剩余污泥超聲提取液作為培養基可以培養穩定高效的破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1.

剩余污泥；資源化；超聲法；生物破乳菌；培養基

活性污泥法是目前使用最為廣泛的污水處理方法,具有處理效率高、處理成本低的優點.但該法在污水處理的同時產生大量的剩余污泥,其處理處置給人們帶來了許多技術和經濟投入上的問題及挑戰[1-2].目前最常用的剩余污泥處置方法是填埋,占用了大量的空間資源[2-3],也浪費了污泥中蘊藏的大量物質能量資源.在污泥最終處置前采用適當的方法對其中的資源進行利用,一方面可以資源化利用這些物質,另一方面也有利于減少最終處置的成本和壓力.近年來,國內外對剩余污泥的資源化途徑研究主要包括制備建材[4]、吸附劑[5]以及厭氧產氣[6-8]、熱解制油[9]等,利用剩余污泥生產具有高附加值生物制品的研究也有所進展,如成功培養 PHAs合成菌[10]以及生物殺蟲劑生產菌[11]等.

剩余污泥經過破解后才能釋放其中的有機質及各類營養元素.超聲法是一種常見的用于破解污泥的預處理方法,具有操作簡單、處理效率高等優點[12-13].在對剩余污泥進行超聲的過程中,超聲波引起的“空穴現象”[14]能夠達到破解污泥的效果.低頻高聲能密度的超聲波能有效打碎污泥絮體并溶解其中的菌體細胞[15],令其中碳、氮、磷和其他各類營養元素進入液相,使剩余污泥具備了能夠生產具有高附加值生物制品的潛力.

生物破乳劑是生物表面活性劑的一種,能夠對乳狀液進行破乳,實現油水的分離.與化學破乳劑相比,生物破乳劑具有高效、低毒性、易生物降解等特點,可廣泛應用于原油乳狀液破乳、含油廢水處理、食品加工、生物制藥等領域[16].前期研究中,從油田含油土壤中篩選得到一株破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1,在原油乳狀液和模型乳狀液中具有較好的破乳效果[17-18],但由于其生產成本較高,因此其大規模應用受到了限制.

開發廉價碳源是降低生物破乳劑成本的途徑之一[19-20],本課題組前期曾研究嘗試使用廢棄油脂等廢棄物替代培養基中的碳源以降低破乳菌生產成本[21].但使用廢棄物取代生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1合成培養基的研究仍是空白.本研究以剩余污泥這種廉價原料超聲后獲得的污泥提取液取代無機鹽培養基(MMSM)用于生物破乳菌的培養,研究 S-XJ-1在污泥提取液中的生長情況,以期為生物破乳劑低成本生產和剩余污泥資源化提供一種新的途徑.

1 材料與方法

1.1 剩余污泥

本研究使用的剩余污泥來源于上海曲陽污水廠污泥濃縮池.取得污泥后,將其在 4℃條件下自由沉降 24h進行濃縮,得到用于超聲處理的剩余污泥樣品,其性質見表1.

1.2 超聲處理及污泥提取液的制備

超聲處理采用 BRANSON ultrasonic, Co, USA Model 250細胞破碎儀,1/2″探頭,工作頻率20kHz.運行模式為超聲5s,停止5s.超聲污泥體積350mL,設置0℃冰水浴環境.

表1 剩余污泥樣品性質Table 1 Properties of excess sludge

本研究選取不同超聲能量(ES, kJ/kg TS)對污泥樣品分別進行預處理考察不同超聲能量對污泥破解的影響.超聲能量的定義見式(1):

式中:P為超聲功率,W;t為作用時間,s;V為污泥體積,L;TS為污泥總固體濃度,g/L.

超聲結束后,將所得的污泥混合液在12000r/min離心10min,隨后經0.45μm濾膜過濾,即得到澄清的污泥提取液樣品.

1.3 生物破乳菌的培養

本試驗采用的菌種為一株由新疆克拉瑪依油田受石油污染土壤中篩選得到的高效破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1.傳統的培養方式采用的是無機鹽培養基(MMSM),其組分為(g/L):NH4NO3, 4.0;K2HPO4,4.0;KH2PO4,6.0;MgSO4·7H2O,0.2; CaCl2·2H2O,1.0×10-3;FeSO4·7H2O,1.0×10-3;EDTA, 1.4×10-3.碳源為4%(V/V)液體石蠟.

本研究中使用污泥提取液替代MMSM培養基進行生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1的培養,培養過程為:將培養基的 pH值調至 7.0,以250mL三角燒瓶分裝100mL培養基與4%液體石蠟(V/V),121℃高壓蒸氣滅菌 20min(1×105Pa),冷卻至室溫后,向其中接入10%(V/V)的種子培養液,在恒溫搖床中于35℃,130r/min下培養7d.

1.4 分析方法

1.4.1 污泥破碎程度 污泥超聲后的破解情況通過DDCOD(degree of disintegration)[15]來評價,其定義見式(2):

式中:CODultrasound為超聲處理后上清液樣品的COD,mg/L;CODoriginal為未經超聲處理的污泥上清液的 COD,mg/L;CODNaOH為污泥樣品與1mol/L NaOH以1:2體積比混合后,在20℃下使用磁力攪拌器勻速攪拌反應 24h后經離心過濾獲得的上清液COD.

1.4.2 污泥提取液成分 污泥提取液中總有機碳采用總有機碳測定儀(TOC-VCP Analyzer, SHIMADZU, JAPAN)測定.氨氮、凱氏氮通過蒸餾法測定(K9840凱氏自動定氮儀,濟南海能儀器有限公司),有機氮則通過凱氏氮減去氨氮獲得.總磷使用鉬銻抗分光光度法測定(UV-2100,尤尼柯上海儀器有限公司).污泥提取液中金屬元素含量采用電感耦合等離子發射光譜法測定(ICP-AES 720ES, Agilent).

1.4.3 生物破乳菌產量 采用干重法表示,將培養 7d后的全培養液于 12000r/min,4℃下離心10min,將離心所得物于-50℃冷凍干燥24h(Scientz-10N,寧波新芝生物科技股份有限公司)后稱重,產量以g/L計.

1.4.4 破乳性能 菌體破乳性能參照 Huang等

[17]的方法:將菌體干粉加蒸餾水配成濃度為10g/L的菌懸液用于破乳實驗,采用的模型乳狀液為W/O型,具體配制方法參照文獻[22].破乳實驗采用瓶試法[23].破乳率的具體計算公式如下:

1.4.5 菌體細胞表面疏水性 細胞表面疏水性采用微生物黏著碳烴化合物法(MATH)測定,測試方法同Huang等[17].

1.4.6 菌體C/N 菌體C/N采用有機元素分析儀Vario EL(Vario EL,Elementar Analyser system. GmbH, Hanau, Germany)在CHN模式下測定生物破乳菌菌體元素組成后計算所得.

2 結果與討論

2.1 超聲能量對污泥破解的影響

如圖1所示,隨著ES的升高,污泥的DDCOD逐漸上升,破解程度呈遞增趨勢.在能量達到56647kJ/kg TS時得到最大的破解程度,為54.93%.當ES在0～42485kJ/kg TS范圍內,DDCOD會隨超聲能量的提高明顯上升,污泥破碎程度與超聲比能呈正相關,但之后使用更高的超聲能量,污泥的破碎程度很難繼續提高,表明此時污泥的破碎程度已經接近極限.該結果與Bougrier等[8]和Lehne等[24]獲得的結果相近.在污泥破解的過程中,隨著超聲強度的提高,污泥中揮發性懸浮固體(VSS)占懸浮固體(SS)的百分比也逐漸下降,從未經超聲時的 66.00%至56647kJ/kg TS時達到最小值34.47%,其與DDCOD呈現相反的趨勢,且在能量大于42485kJ/kg TS之后放緩下降的速度.污泥 DDCOD上升的比例與VSS/SS下降均體現了污泥固體中有機物向液相中轉化的過程,當污泥破碎程度接近極限時,原污泥固體中有大量的有機物釋放到液相中.

圖1 不同超聲條件對污泥破解效果的影響Fig.1 Influence of ESon the disintegration degree of excess sludge

2.2 超聲能量對污泥提取液氮、磷元素釋放的影響

氮源、磷源的種類和含量是培養基中影響生物破乳菌合成的重要因素.由圖 2可見,氨氮和有機氮的濃度隨超聲能量的提高而增大,分別從16.24, 0.33mg/L增長至171.94,142.20mg/L.總磷在未超聲的污泥清液中濃度就較高,達到了 76.29mg/L,超聲后在低能量條件下就以較快的速率釋放,最高濃度可達256.30mg/L.在Es達到42485kJ/kg TS后,污泥提取液中氨氮、有機氮及總磷的增長速度均會放緩,與污泥的破碎情況一致.

圖2 不同超聲條件對污泥提取液中氮磷元素釋放影響Fig.2 Influence of ESon the release of nitrogen and phosphorus in excess sludge

超聲波對污泥中元素的釋放作用可以分為兩部分:超聲波水力剪切力引起的細胞EPS的釋放,以及因超聲波產生的羥基自由基導致細胞破壞帶來的胞內物質的釋放[25].氮元素的釋放主要來源于超聲波對污泥中細胞的破碎作用[8].污泥中的有機氮主要為蛋白質和氨基酸[8],在超聲能量較低時(小于 1000kJ/kg TS),污泥破碎率低,因而釋放的有機氮濃度也較低,隨著能量的提高,溶胞作用發生后,釋放量也得到了較大的提高.剩余污泥中磷元素的釋放也與超聲波對細胞的破碎作用有重要關系.剩余污泥中的磷元素主要來源于聚磷菌貯藏在細胞內的聚磷酸鹽,當細胞被破碎后,聚磷酸鹽會從細胞質中擴散出來[26],進入液相.超聲處理前剩余污泥上清液中的磷元素濃度就較高,可能是污泥在采樣后一直處于厭氧狀態,發生了釋磷現象.

2.3 超聲能量對污泥提取液金屬元素釋放的影響

培養基中的微量金屬元素對破乳菌的合成也起到非常重要的作用,K、Ca、Mg、Fe均為MMSM培養基中所含Alcaligenes sp. S-XJ-1生長必須的金屬元素.而超聲處理后的污泥提取液中也還包含一定種類的金屬元素.由圖4可見,污泥提取液中富含K、Ca、Mg元素,Fe元素含量較少.在能量為0～7081kJ/kg TS時,K和Mg含量隨超聲能量有一定的升高,當超聲能量大于7081kJ/kg TS后,其上升幅度減小,而超聲能量對污泥提取液中Ca、Fe的濃度影響不大.除了這4種微量元素外,污泥提取液中還含有Al、Li、As等元素,但濃度較低,其中 Li、As濃度均低于0.10mg/L.而如Cr、Cd、Mn、Pb等其他有毒重金屬元素,則未在污泥提取液中檢出.

圖3 不同超聲條件對污泥提取液微量金屬元素釋放的影響Fig.3 Influence of ESon the release of metalic elements in excess sludge

由上述結果可知,污泥提取液包含了生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1生長所需的各類元素,且有毒重金屬元素含量較低,具有作為破乳菌培養基的可行性.但與MMSM培養基相比,其中元素的種類、含量大小差異較大.本研究中,為了保證菌體的正常生長,在污泥提取液中投加 4%的液體石蠟作為碳源,以避碳源種類和數量對菌體合成產生的影響[27].在此基礎上考察污泥提取液取代MMSM培養基中其他元素及生長環境進行破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1的可行性.

2.4 不同污泥提取液對生物破乳菌產量的影響

將 9種超聲強度獲得的污泥提取液作為培養基培養高效生物破乳菌 Alcaligenes sp. SXJ-1,試驗結果如圖4所示.破乳菌的產量與污泥提取液的超聲能量呈正相關.可以發現,超聲能量為443kJ/kg TS對應的污泥提取液培養菌體所得的產量為 1.164g/L,略低于 MMSM 培養基(1.207g/L).當超聲能量大于885kJ/kg TS后,污泥提取液培養菌體產量大于 MMSM培養基,使用超聲能量為885～56647kJ/kg TS的污泥提取液培養生物破乳菌,產量可提高 0.3%～68.3%.在比能為 56647kJ/kg TS時生物破乳菌最高產量為2.03g/L.說明污泥提取液中營養元素濃度越高,獲得的菌體產量也越大.

圖4 不同污泥提取液對培養生物破乳菌產量的影響Fig.4 Influence of sludge extract on biomass of the demulsifying strain

如圖4所示,經7d培養后,污泥提取液的pH值相比培養初始值 pH=7.0有不同程度的下降,443kJ/kg TS對應的污泥提取液pH下降最多,為5.78,在此pH值下菌體的合成會受到嚴重的抑制[28]..隨著超聲能量的提升,培養基初始pH緩沖能力越好,污泥提取液pH下降值逐漸減小,培養所得菌體的產量也越大.培養基的pH緩沖能力對破乳菌的合成效果有重要影響[27].由前期研究成果[27]可知,S-XJ-1是一株在中性和堿性環境下生長良好的菌,但在酸性環境下產量會明顯下降,培養基初始pH=6.0時獲得的菌體產量僅為初始pH=7.0時的一半.在培養過程中,菌體對碳水化合物的代謝會引起培養基 pH的下降[2],從而對破乳菌的合成產生抑制.類似的,一株產表面活性劑菌B.subtilis MTCC 2423在pH=6.5與pH=7.0的條件下生長,生物量會相差近一倍,表面活性劑產量相差30%[29].而Peseudomonasaeruginosa MR01在pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的條件下生長,菌體產量差別顯著,分別為 0.05,0.20,1.65,1.67,1.72mg/L[30].當比能大于42485kJ/kg TS后,污泥提取液的pH值能保持在 6.60以上,與 MMSM 培養基(pH= 6.68)差異很小,說明污泥提取液已經具有足夠的pH緩沖能力.

分析污泥提取液能夠提高生物破乳菌產量的原因,可能是由于污泥經超聲處理后釋放的營養元素更易被菌體利用,且污泥提取液中存在的氨基酸等物質對生物破乳菌的生長起到了促進作用.Maria等[3]在使用經過高溫水解所得的污泥提取液培養生物殺蟲劑產生菌 Bacillus thuringiensis菌的研究中發現,預處理后污泥中易被菌體利用的碳源、氮源和其他生長所需營養元素的含量均會有所上升,從而促使菌體產量提高.研究發現,污泥提取液中氨氮與有機氮的濃度與菌體產量有良好的線性關系(R2=0.995與R2=0.983).污泥提取液中存在的作為氮源的物質可能是提高菌體產量的關鍵,需進一步研究.

2.5 不同污泥提取液對生物破乳菌破乳性能的影響

將污泥提取液培養得到的生物破乳菌進行破乳試驗,考察污泥提取液對合成的破乳菌破乳性能的影響,試驗結果如圖5所示.各污泥提取液培養破乳菌在 1000mg/L投加量下,對于模型乳狀液24h的破乳率在78.3%～84.4%之間,其中脫油率在78.7%～90.2%,脫水率75.2%～83.0%.破乳性能最好的為超聲能量為42485kJ/kg TS對應的污泥提取液培養的菌體,與 MMSM培養基培養的菌體對模型乳狀液的 24h破乳率(92.5%)相差不大.說明污泥提取液合成的生物破乳菌破乳性能能夠達到預期的要求.

生物破乳菌的破乳性能與菌體細胞表面疏水性以及菌體表面物質元素組成有密切相關.前期研究結果表明[31],菌體表面的疏水性與菌體的破乳能力呈正相關,而菌體表面蛋白含量的升高會導致菌體表面疏水性的增強.由圖6可知,不同污泥提取液培養菌體的疏水性差異并不顯著,在81.09%～90.94%之間,與MMSM培養基培養的菌體(88.49%)相近.測定不同污泥提取液培養的破乳菌菌體的C/N后發現,9種污泥提取液培養所得菌體的C/N在5～6之間,與MMSM培養基培養所得菌體(C/N=5.00)差異也不大.這表明,使用污泥提取液為培養基培養的生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1菌體表面性質與元素組成與 MMSM培養基培養的菌體相近,故其在破乳性能上也沒有明顯差異.

圖5 不同污泥提取液培養生物破乳菌的破乳性能Fig.5 Influence of sludge extract on the demulsfication performance of the demulsifying strain

圖6 不同污泥提取液培養破乳菌的疏水性與C/NFig.6 Influence of sludge extract on the CSH and C/N of the demulsifying strain

3 結論

3.1 超聲能量為 443～56647kJ/kg TS獲得的污泥提取液中氨氮、有機氮、總磷的濃度最高分別為171.94,142.20,76.29mg/L.

3.2 污泥提取液(ES為 885～56647kJ/kg TS)合成高效破乳菌 Alcaligenes sp. S-XJ-1,產量較MMSM培養基可提高 0.3%～68.3%,其中 ES為56647kJ/kg TS時破乳菌產量最高,為2.03g/L,同時菌體的破乳性能保持穩定.

3.3 污泥提取液中的氮、磷、金屬元素及 pH緩沖能力能夠替代MMSM培養基滿足S-XJ-1生長的需求,污泥提取液的有機氮濃度可能是破乳菌產量提高的關鍵因素.

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Cultivation of demulsifying bacteria Alcaligenes sp. S-XJ-1 using ultrasonic pretreated excess sludge.

HUANG

Xiang-feng, ZHU Qi-wei, SHEN Chang-ming, WANG Kun, LU Li-jun, LIU Jia*(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science, 2014,34(2)：424～430

In order to find a new way of excess sludge utilization, sludge extract was used in the biosynthesis of demusifier by Alcaligenes sp. S-XJ-1. It was practical to cultivate highly efficient demulsifying strains in sludge extract. Sludge extract was obtained by the untrasound condition of 443～56647kJ/kg TS. In sludge culture medium, maximun concentration of ammonia nitrogen, organic nitrogen and phosphorus were 171.94,142.20 and 76.29mg/L. Sludge extract contained metallic elements such as K, Ca, Mg, Fe that were essential to the synthesis of S-XJ-1. After 7days cultivation, the biomass of S-XJ-1in sludge extract was 0.3%～68.3% higher than that in MMSM. Highest yield (2.03g/L) was obtained when specific energy was 56647KJ/kg TS. pH buffering capacity and concentration of organic nitrogen might have a great impact on the yield. The bio-demusifier produced with sludge extract had a quite stable demusifying ration of 80%, of which the CSH and C/N did not show much difference to that with MMSM.

excess sludge；utilization；ultrasounication；demulsifying strains；culture medium

X703

：A

：1000-6923(2014)02-0424-07

黃翔峰(1974-),男,福建古田人,教授,博士.主要從事生物破乳劑以及剩余污泥資源化相關研究.發表論文100余篇.

2013-06-14

國家自然科學基金項目(51108333);國家科技支撐計劃(2012BAC11B00)

* 責任作者, 講師, liujia@tongji.edu.cn